VEGFR-3、APC、P53蛋白在胃癌及癌前病变中的表达及与淋巴结转移的相关性分析

张 辉，金 瑞，郑鸾鸾，毛渭东

胃癌为临床常见的一种恶性肿瘤，在我国其发病率及病死率居恶性肿瘤第一位[1-2]，因此，在早期对胃癌进行及时诊断和治疗有利于提高患者存活率。目前，对胃癌的早期诊断主要依赖于对胃癌前期变化的随访[3]，而癌前期变化又包括癌前疾病和癌前病变，癌前疾病包括萎缩性胃炎和胃腺瘤，癌前病变包括肠上皮化生和不典型增生[4-5]。由于胃癌通常是一个多阶段和多步骤的发展过程，且胃黏膜上皮细胞的增殖分化一般处于动态平衡的状态，其中这种平衡的维持主要作用于癌基因、抑癌基因和一些生长因子的调控[6]。研究显示，抑癌基因(P53)具有致癌作用[7]，已有研究报道其在胃癌组织中呈高表达[8]，但相关基因在胃癌癌前病变中表达情况的报道较少。本研究主要检测血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、结肠腺瘤性息肉病(APC)蛋白和P53蛋白在胃癌及癌前病变中的表达情况，并分析其与胃癌淋巴结转移的相关性，探讨其在胃黏膜病变形成过程中的作用及对胃癌早期诊断的意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年3月—2020年3月于我院行胃切除及胃镜活检标本130例，男73例，女57例；年龄33～73(60.32±10.45)岁；病理组织学类型：肠上皮化生35例，异型增生42例，胃癌53例。纳入标准：患者均表现为不同程度的腹胀、腹痛、恶心、嗳气、呕吐或反酸等；临床资料相对完整；对本研究知情且签署知情同意书者。排除标准：既往做过胃相关手术者；接受过化疗、放疗或免疫治疗者；正在服用激素、非甾体类消炎药、免疫抑制剂、前列腺素及类似药物者；2周内服用质子泵抑制剂、铋剂、抗生素等抗幽门螺杆菌药物。选取胃癌手术标本断端正常胃黏膜组织32例作为对照组，男18例，女14例；年龄32～73(59.15±10.87)岁。胃癌、癌前病变及正常胃黏膜患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2方法 将所有标本放入10%中性甲醛溶液中固定，然后用石蜡包埋进行切片，采用免疫组织化学(IHC)检测各组织中VEGFR-3、APC和P53蛋白的表达情况。IHC具体操作步骤：采用二甲苯对切片进行脱蜡，然后按由低到高的顺序将其放入不同浓度的乙醇中脱水，蒸馏水冲洗3次，每次3 min，待充分水化后，用PBS洗3次，每次5 min，将玻片周围擦干后，加入3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶10 min，再用PBS洗3次，每次5 min，将玻片周围擦干后，室温下滴加20%正常羊血清封闭30 min，然后滴加适当比例的一抗，于37 ℃下孵育1～2 h或4 ℃过夜，再用PBS洗3次，每次5 min，再加入Envision试剂(HRP/R)，放入37 ℃恒温箱中30 min，用PBS洗3次后，再用DAB进行显色，苏木素复染，用中性树胶封片。

1.3结果判定 每张切片均安排两名不知患者临床病理资料的病理医师进行判读，依照Fromowitz综合计分法[9]，结合细胞着色强度和阳性着色细胞所占百分比进行综合判定，其中细胞着色强度判定标准：棕褐色计3分，棕黄色计2分，淡黄色计1分，不着色计0分。阳性细胞百分数为10个视野阳性细胞的平均数占这10个视野中细胞数的百分比，评分标准：>75%计4分，50%～75%计3分，25%～50%计2分，5%～25%计1分，≤5%计0分。最后将二者积分相加，0～2分为阴性，>2分为阳性。其中阳性对照为已知阳性的胃癌组织切片，阴性对照用PBS代替一抗。

1.4观察指标 统计不同胃黏膜组织中VEGFR-3、APC和P53蛋白表达情况；收集胃癌患者的各项临床资料，包括性别、年龄、镜检获取的肿瘤直径、分化程度、临床分期和淋巴结转移情况等。

1.5统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，采用多因素Logistic回归分析胃癌淋巴结转移的危险因素。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1VEGFR-3、APC、P53蛋白在不同胃黏膜组织中的表达情况 VEGFR-3和P53蛋白在胃癌组织中的阳性表达率高于异型增生、肠上皮化生和正常胃黏膜组织，且在异型增生组织中的阳性表达率高于肠上皮化生和正常胃黏膜组织(P<0.05)。APC蛋白在胃癌、异型增生和肠上皮化生组织中的阳性表达率低于正常胃黏膜组织(P<0.05)，而在胃癌、异型增生和肠上皮化生组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 VEGFR-3、APC、P53蛋白在不同胃黏膜组织中的表达情况[例(%)]

2.2胃癌淋巴结转移的单因素分析 53例胃癌中，28例发生淋巴结转移。单因素分析显示，肿瘤直径、分化程度、临床分期、VEGFR-3阳性表达与胃癌淋巴结转移有关(P<0.05,P<0.01)，而性别、年龄、肿瘤位置、APC和P53蛋白表达与淋巴结转移无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 53例胃癌淋巴结转移的单因素分析[例(%)]

2.3胃癌淋巴结转移多因素Logistic回归分析 将上述单因素分析显示差异有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归分析，结果显示分化程度为低中分化、临床分期为Ⅲ/Ⅳ期、VEGFR-3阳性为胃癌淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 胃癌淋巴结转移危险因素多因素Logistic回归分析

3 讨论

胃癌的发生与发展通常涉及多方面的因素[10]，其病理进展顺序多为正常胃黏膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生、胃癌[11-13]。另外也有学者证实癌组织通常由肠上皮化生发展而来[14]，因此认为可将肠上皮化生作为胃癌癌变过程中的一个重要环节，不过目前尚缺乏肠上皮化生在胃癌癌变过程中起作用的分子生物学直接证据[15]，因此本研究探讨几类不同类型的基因在胃癌及癌前病变中的表达情况。

由于VEGFR-3信号通路在肿瘤发生的病理过程中调控肿瘤淋巴管的发育及增殖[16-17]，故本研究通过IHC法对VEGFR-3蛋白在胃癌组织及癌前病变中的表达水平进行检测，结果显示VEGFR-3蛋白在胃癌组织的阳性表达率高于异型增生、肠上皮化生和正常胃黏膜组织，与修丽娟等[18]研究结果一致，说明VEGFR-3参与胃癌发生的病理过程。另外在临床上，通常认为结肠家族性腺瘤样息肉癌变与APC基因异常有关[19-20]，不过，近年随着对该基因研究的深入，发现其除与结肠癌的发生有关外，同时还对胃癌的发生和发展起重要作用[21]，因此本研究对该基因在胃癌组织中的表达进行研究，发现APC蛋白在胃癌、异型增生和肠上皮化生组织中的阳性表达率低于正常胃黏膜组织，而在胃癌和癌前病变组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义，表明在癌前病变胃黏膜组织中APC基因已出现异常表达，可见APC基因在胃癌的早期阶段即参与了胃癌的发生。P53是由10个内含子和11个外显子组成的肿瘤抑制基因[22-23]。有研究已证实P53基因的突变是胃癌发生的原因之一，具有致癌作用[24]。本研究结果显示，P53蛋白在胃癌组织中的阳性表达率高于异型增生、肠上皮化生和正常胃黏膜组织，提示P53与胃癌的发生关系密切，而P53蛋白在异型增生组织中的阳性表达率高于肠上皮化生和正常胃黏膜组织，进一步说明该蛋白的过表达在胃癌的发生、发展过程中均起重要作用。

本研究单因素分析结果显示，肿瘤直径、分化程度、临床分期、VEGFR-3阳性表达与胃癌淋巴结转移有关，而性别、年龄、肿瘤位置、APC和P53蛋白表达与淋巴结转移无相关性。多因素Logistic回归分析结果显示，分化程度为低中分化、临床分期为Ⅲ/Ⅳ期、VEGFR-3阳性为胃癌淋巴结转移的独立危险因素。OZMEN等[25]研究表明，VEGFR-3的表达与胃癌淋巴结转移有关。不过本研究也具有一定局限性，即所纳入样本量较小，同时无癌前病变的跟踪随访资料，所采用的试验方法也较简单，可能受影响因素较多，在广泛应用于临床之前，还需进一步研究。

综上所述，VEGFR-3和P53蛋白在胃癌及癌前病变组织中阳性表达率高，认为P53和VEGFR-3的过度表达是胃癌发生过程的较早期事件，APC蛋白阳性表达率低，可将其作为临床辅助诊断指标，且VEGFR-3与胃癌淋巴结转移密切相关，可用于评估胃癌的发生、发展。