干细胞与结核分枝杆菌交互作用的研究进展

郭倩 申晨 申阿东

结核分枝杆菌是一种胞内致病菌，由其感染所引起的人类结核病被称为是全球头号传染病杀手。长久以来，巨噬细胞、树突细胞等吞噬细胞被认为是结核分枝杆菌生长的主要宿主细胞[1]，经由呼吸道等入侵的结核分枝杆菌可通过多种配体-受体途径被宿主吞噬细胞识别和吞入[2-3]，通过吞噬细胞的固有杀伤能力和随后启动T淋巴细胞免疫为主的获得性免疫反应对结核分枝杆菌进行杀伤和清除。目前的研究表明，结核分枝杆菌不仅能够在吞噬细胞内存活，还能够感染以宿主造血干细胞和间充质干细胞为代表的干细胞，并在其中潜伏和增殖[4-6]。

干细胞是一类具有自我复制和自我更新能力的多潜能细胞，其通常被描述为位于不可逆细胞分化等级最高的离散细胞群，可以通过特定细胞表面标记物对其进行区分和分类。根据发生学来源可分为胚胎干细胞和造血干细胞，根据可以分化产生细胞类型的数量，可分为单能、多能和全能干细胞。造血干细胞和间充质干细胞属于多能干细胞。

干细胞具有自我更新、产生低水平活性氧、表达药物外排泵等能力[7-8]，有助于结核分枝杆菌发生药物逃避和持久生存；同时，其可以高度迁移/穿梭于骨髓、循环血和结核肉芽肿之间[9-10]，有助于结核分枝杆菌发生血源性播散。因此，干细胞对于维持结核分枝杆菌在宿主体内的休眠和传播具有十分重要的意义[11]。

一、结核分枝杆菌持久感染损伤造血干细胞增殖和转录

造血干细胞是血液系统中一类具有造血功能的异质性成体干细胞，其差异表达白细胞分化抗原簇(cluster of differentiation, CD) 45和CD34等表面分子。正常情况下，大部分造血干细胞在骨髓中处于静止状态，仅有一小部分为造血提供需要。但当出现失血、感染等应激情况时，造血干细胞会被迅速激活，在骨髓中增殖并随后进入外周血。造血干细胞在胸腺激素的诱导下可分化成具有免疫活性的T淋巴细胞，活化的T细胞在结核分枝杆菌感染个体的抗结核细胞免疫应答中具有重要作用。骨髓外T细胞可通过产生细胞因子(如白细胞介素-2、γ-干扰素等)以确保造血干细胞分化血细胞的平衡输出和自我更新的终生维持[12-13]。

结核分枝杆菌可能直接感染造血干细胞并在其内潜伏或增殖。有研究人员发现，异基因造血干细胞移植后的个体患活动性结核病的风险是普通人的2～40倍[14]，其原因一方面可能是移植前受体体内休眠的结核分枝杆菌在移植后由于免疫功能处于抑制状态而被激活，另一方面也提示一些移植供者的造血干细胞可能携带结核分枝杆菌[15]。Tornack 等[6]在小鼠淋巴细胞活化信号分子相关受体家族(SLAM)CD150+的造血干细胞亚群中找到了结核分枝杆菌感染造血干细胞的直接证据——上述细胞内均能够检测出结核分枝杆菌的核酸。由于上述细胞中的结核分枝杆菌能够表达休眠生存调节子(dormancy survival regulon，DosR)和热休克蛋白X(HspX)等休眠相关基因，提示结核分枝杆菌感染造血干细胞并在其内休眠。在结核分枝杆菌侵入宿主细胞后，长期持久抗原刺激可诱导T细胞分泌多种细胞因子[16]，其中γ-干扰素和白细胞介素-2表达水平的平衡被认为在维持造血干细胞稳态中起着至关重要的作用[17]。Li等[18]构建小鼠感染模型，用结核分枝杆菌毒力蛋白——早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)构建的融合蛋白对小鼠分别进行瞬时灌注刺激(对照组)和持续灌注刺激(实验组)。12周后发现，实验组小鼠CD4+T细胞产生的γ-干扰素浓度高于对照组，白细胞介素-2浓度低于对照组，γ-干扰素浓度的持续增高降低了细胞谱系分化抗原 (-)和Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族蛋白c-Kit(+)造血干细胞/造血祖细胞的增殖活性，损害造血干细胞的增殖和自我更新，继而导致造血干细胞耗竭[18-19]。此外，γ-干扰素的高水平表达还会通过上调碱性亮氨酸拉链结构域转录因子Batf2[20]和干扰素调节因子IRF8[21]的表达，诱导造血干细胞及造血祖细胞向髓系细胞分化[21]；而补充白细胞介素-2可通过激活调节性T细胞和下调γ-干扰素恢复造血祖细胞的增殖活性，维持造血干细胞正常造血[17-18]。

二、结核分枝杆菌感染减弱了间充质干细胞的免疫调节作用

间充质干细胞作为一种来源于发育早期中胚层的非造血干细胞，具有免疫调节功能，可通过细胞间的相互作用及分泌细胞因子来抑制T细胞的增殖及介导的免疫反应。而可与之相混淆的另一概念“间充质基质细胞”被认为主要具有显著的分泌、免疫调节等功能[22]；尽管间充质干细胞和间充质基质细胞早在50多年前就已被发现，且国际细胞和基因治疗学会及间充质基质细胞委员会也明确阐述了两者的区别和不可互换性[23]，并分别以英文字母缩写MSCs和MSC指代，但是有研究对这两个术语没有进行明确的区分，间充质干细胞也被指代间充质基质细胞，例如，Saalbach和Anderegg[24]探讨间充质细胞多分化能力时，其描述与间充质干细胞的概念相一致。因此，笔者在文中所述间充质干细胞不除外间充质基质细胞。

Beamer等[4]和Das等[11]猜测骨髓间充质干细胞可能是休眠期结核分枝杆菌长期存活的宿主细胞之一且参与结核病的发病机制，继而通过用绿色荧光蛋白荧光标记结核分枝杆菌的方法对这一猜测进行验证，发现结核分枝杆菌可在体外感染间充质干细胞，其中低亲和力神经生长因子受体(NGFR/CD271, 肿瘤坏死因子受体超家族成员)阳性的间充质干细胞是结核分枝杆菌最容易感染的间充质干细胞类型。此外，研究也表明，在异烟肼和利福平抗结核治疗过程中，实验小鼠肺和脾中的结核分枝杆菌含量快速减少，但仍有少量的结核分枝杆菌可在间充质干细胞中持久存活，这表明结核分枝杆菌感染的间充质干细胞为结核分枝杆菌持久存活提供了一个相对适宜的细胞内环境，而且被感染的间充质干细胞内处于休眠期的结核分枝杆菌仍然具有再感染健康组织的能力[4]。

由于γ-干扰素和α-干扰素等炎性细胞因子在结核分枝杆菌感染后增高[25]，巨噬细胞内结核分枝杆菌的生存压力较大；而间充质干细胞具有自我更新、相对静止及只产生低水平内源性活性氧等多种特性，其为结核分枝杆菌的潜伏提供了有利条件。一方面，结核分枝杆菌减弱间充质干细胞的自噬和一氧化氮介导的杀伤作用; 另一方面，脂质介质前列腺素E2有助于骨髓间充质干细胞表现出亲细菌的特性[10]，而结核分枝杆菌具有富含脂质的细胞壁且能通过促进间充质干细胞中脂质合成并留在脂质体内以逃避宿主适应性免疫反应[11]。此外，结核分枝杆菌还可通过上调自身DosR等休眠相关基因的持续表达进入休眠状态，休眠的结核分枝杆菌对常规抗结核药品反应差，通常仅可通过诱导自噬消除[26]。间充质干细胞也可被招募至肉芽肿周围[10]，被结核分枝杆菌感染的间充质干细胞可通过自噬和一氧化氮介导的杀伤作用来限制结核分枝杆菌的存活[27]。而与驻留在巨噬细胞内的结核分枝杆菌不同，间充质干细胞中的结核分枝杆菌对抗结核药品的耐受性非常好，这可能和缺氧、低水平一氧化氮、药物转运蛋白表达较高和空泡型H+ATP酶表达低[10]等有关。因此，或许可以通过增强间充质干细胞的自噬能力或采用体外扩增的间充质干细胞辅助治疗，从而将患者机体内的慢性炎症转化为有益的免疫反应，改善其临床预后。

三、干细胞在结核病预防及免疫治疗中的应用

(一)造血干细胞在结核病免疫治疗中的应用

1.造血干细胞表面蛋白可用于开发新疫苗：卡介苗是一种能够增强免疫、预防结核病最直接也唯一被认可的方法，卡介苗接种后进入骨髓，改变了造血干细胞和多能祖细胞的转录微环境[21]，并诱导分化产生针对结核分枝杆菌的记忆T细胞，对预防结核病尤其是婴幼儿期播散性结核病具有重要作用[28]。目前，卡介苗发挥免疫防御作用的机制并不完全清楚。Kaufmann等[21]通过构建小鼠模型，发现卡介苗可使细胞谱系分化抗原阴性且Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族蛋白c-Kit和淋巴细胞抗原6复合体A双阳性细胞(LKS+细胞)增殖相关基因表达上调，并促进CD150-且Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族蛋白c-Kit和淋巴细胞抗原6复合体A双阳性细胞(LKS+细胞)及CD48+的多能祖细胞向髓系分化，从而间接调控造血干细胞向造血祖细胞及造血祖细胞向单核细胞的分化，即卡介苗能够提高巨噬细胞对结核分枝杆菌的固有免疫、增强巨噬细胞活性以及T淋巴细胞的活化，这些细胞可提供比初始单核/巨噬细胞更有力的抗结核防御作用，具有较强的杀菌能力，并且这种具有强杀菌能力的单核/巨噬细胞在体内具有一定持久性，提示识别造血干细胞标志性蛋白可作为开发抗结核和其他传染病疫苗的一种新策略。

2.造血干细胞基因修饰预防结核分枝杆菌感染：Hetzel 等[29]研发了一种造血干细胞基因治疗方法，使用特异性表达γ-干扰素受体1基因(Ifngr1)的慢病毒载体，在卡介苗感染前将基因矫正的造血干细胞移植到Ifngr1缺失的小鼠体内，结果发现，接受移植的小鼠巨噬细胞可稳定表达Ifngr1，还可预防严重卡介苗病，并恢复肺和脾巨噬细胞的抗分枝杆菌活性，保护小鼠免受严重的结核分枝杆菌感染，是一种基于造血干细胞免疫基因修饰预防感染的策略。

(二)间充质干细胞通过免疫调节限制结核分枝杆菌感染

间充质干细胞是一种新型免疫细胞，具有免疫调节、组织修复和抗菌等功能，可通过自噬、分泌自由基、表达清道夫受体和甘露醇受体来限制结核分枝杆菌的存活[27]。雷帕霉素可诱导间充质干细胞自噬，增强间充质干细胞对结核分枝杆菌的吞噬杀伤作用[30]。间充质干细胞还可以通过释放活性氧和NO来抑制胞内结核分枝杆菌的活性[27]。

此外，间充质干细胞可以在体外诱导增殖，采用体外扩增的自体间充质干细胞进行移植治疗，可将体内慢性炎症反应转化为有益的免疫反应。Choi等[31]采用脓肿分枝杆菌模拟结核分枝杆菌感染小鼠建模，将小鼠随机分为实验组和对照组并分别注射体外扩增的间充质干细胞和磷酸盐平衡液。结果发现，注射间充质干细胞小鼠的荷菌量较少且存活时间>15 d的概率较大，且注射剂量越大存活率越高。另一项研究表明，间充质干细胞对膀胱结核有一定辅助治疗作用[32]；耐药和多耐药结核病患者在接受自体骨髓来源的间充质干细胞治疗后，胸部X线摄影检查结果和患者病情得到显著改善[33]。Skrahin等[34]在一项研究中指出，自体骨髓间充质干细胞辅助治疗与临床不良事件及急性毒性反应无明显关系，仅可能出现暂时性发热,其对结核病患者似乎是安全的。因此，间充质干细胞有望成为限制结核分枝杆菌感染和结核病病情发展的潜在治疗靶点。

(三)胚胎干细胞与抗结核新药研发

胚胎干细胞在体外特定培养条件下可分化为与经典巨噬细胞相似的巨噬样细胞；该巨噬样细胞不仅转录组学和免疫学特征与经典巨噬细胞相似、能够分泌炎性因子(如NO、α-干扰素等)，还能够抑制甚至杀死结核分枝杆菌。Han等[35]通过诱导胚胎干细胞分化增殖为巨噬样细胞，并在此基础上筛选出了一种被称为“10-DEBC”的新型抗结核分枝杆菌药物，为阻碍结核病的发生发展奠定基础。因此，干细胞不仅有可能作为结核病的新型免疫治疗药物，也可以为结核病的新药研发提供筛选模型。

四、总结

作为一类新型免疫细胞，干细胞既能够成为结核分枝杆菌的潜伏存活场所又具有一定的限制结核分枝杆菌生长的能力。尽管研究表明，干细胞可作为免疫靶点或免疫治疗制剂用于调节与结核病相关的感染和炎症，也可能为结核病的新药或疫苗研发提供筛选模型。但是，目前国内关于干细胞与结核病的研究尚处于起步阶段，在将干细胞应用到结核病的临床防治前，仍需要进行大量的科学研究和临床试验来探索其有效性及安全性。