内质网应激介导的细胞凋亡与急性肺损伤的研究进展

练 毅，宫丽荣，余剑波，阚永星

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS) 反应是由多种因素引起的细胞内质网功能障碍，作为细胞重要的自我防御机制，对细胞内稳态发挥重要调节作用，但持久而过度的ERS可能导致细胞功能受损、细胞转化或细胞凋亡。急性肺损伤的发病机制复杂，诱因众多。研究表明，ERS介导的细胞凋亡是多种因素导致的急性肺损伤病理过程中重要的致病因素[1-2]，而肺泡Ⅱ型上皮细胞富有粗面内质网，具有发生ERS的条件和基础，提示ERS介导的细胞凋亡可能是急性肺损伤发病的关键病理生理机制之一。本文就近年来ERS介导的细胞凋亡与急性肺损伤的发生和发展做综述。

1 内质网应激概述

内质网是真核细胞中的一个重要细胞器，包括光面内质网和粗面内质网，其中粗面内质网在蛋白质合成、修饰和加工、折叠、组装以及新生肽链的运输等方面发挥着重要作用。由于蛋白质参与多种生物过程，其“蛋白质平衡”（即其高效合成、折叠和充分降解）对于确保最佳细胞功能和维持组织内稳态至关重要。为了产生适当的蛋白质，内质网腔内的理化条件、分子运输系统、Ca2+浓度、足够数量的分子伴侣、充足的能量、高浓度的专用酶等都需要在正常状态才能有助于蛋白质的折叠和加工；当然，分泌途径和内质网相关降解途径也必须保持完整和功能正常[3]。内质网具有强大的内稳态系统，内环境的稳定性是内质网实现功能的基础，也是维持细胞生命的重要保障。一些生理和病理条件，如缺氧缺血、钙超载、温度和pH值的变化、自由基侵袭、受损DNA的积累、有毒物质的污染、病毒和细菌的感染都会引起内质网功能紊乱，使内质网腔内发生错误折叠、未折叠蛋白大量集聚和钙离子平衡紊乱而产生ERS[4]。ERS的激活并非总是病理损伤性质的，ERS是细胞的自我防御调节机制，旨在通过一系列分子信号通路进行自身调节以恢复内质网自身的正常功能，适度的ERS有利于机体抵御外来刺激、恢复细胞内稳态；但是，强烈的、持续性的ERS反而会导致内质网功能失代偿，启动一系列相关凋亡程序。

2 ERS介导细胞凋亡的主要跨膜信号转导通路

ERS 发生时，主要激活细胞内3条信号通路：即 UPR、固醇调节级联反应和折叠蛋白超负荷反应。其中UPR 是一种进化上保守的生化途径，在内质网应激时细胞主要通过UPR 恢复内稳态，它也是目前研究最为深入的 ERS 活化通路。研究表明，哺乳动物细胞内主要有 3 种 UPR 信号元件，分别是肌醇需求酶1（IREl）、PKR样ER调节激酶（PERK）及活化转录因子6（ATF6）。正常状态下，主要的内质网伴侣分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）与 3 种应信号元件结合处于无活性状态；应激或损伤发生时，GRP78与3种感受器元件解离并经过与错折叠蛋白结合而阻止其输出，这样 3 种感受器游离并激活启动 UPR 从而恢复细胞内稳态[3]。如果ERS 反应过于强烈或持久时，UPR 最终可以启动一系列的凋亡信号分子如ERS特异凋亡蛋白CCAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、半胱氨酸天冬氨酸酶-12（caspase-12）而导致细胞损伤[5]。UPR 控制着细胞促生存和促凋亡之间的转换。

3 ERS的主要凋亡信号分子

研究发现，多种原因导致的ERS可通过不同的信号通路促进细胞生存或者导致细胞死亡。适度的ERS可通过UPR发挥细胞保护作用；然而，ERS过强或持续时间过长时，超过UPR处理未折叠或错误折叠蛋白的能力，将导致内质网功能障碍，引起内环境紊乱。在细胞损伤早期或者损伤较轻时，ERS标志性蛋白分子ATF6、IRE1和PERK的激活能够启动 ERS 促进细胞生存，而过于强烈或持久的ERS同样也能够启动一系列的细胞凋亡信号转导，诱导细胞凋亡。然而 ATF6、IRE1 和 PERK蛋白并不直接引起细胞凋亡，而是通过激活下游靶向凋亡信号分子，目前研究较多的有CHOP及caspase-12[3]。

3.1 CHOP在ERS介导细胞凋亡中的作用 CHOP也被称为GADD153，是细胞内一种调控凋亡通路相关基因的转录因子，它在ERS诱导的细胞凋亡中起重要作用。在正常生理过程中，CHOP在非常低的水平上广泛表达，而当各种因素诱导ERS强烈发生或持久存在时，CHOP的表达急剧上升，这一过程可发生在多种细胞，UPR的3条信号通路均可诱导其表达，但PERK及ATF6是主要的通路[6]。PERK/ATF4/CHOP通路通过与死亡受体通路结合，上调死亡受体4（DR4）和DR5的表达，诱导细胞凋亡，它调节DR4或DR5，或同时调节DR4和DR5诱导细胞凋亡依赖于不同的细胞类型和刺激。CHOP除了通过内源性和外源性途径介导细胞凋亡外，还通过其他途径介导细胞凋亡。如CHOP可以增加Ero1-α（ER还原酶）基因的表达，该基因催化蛋白二硫异构酶的氧化，从而在内质网中产生过氧化氢，内质网的高度氧化状态导致过氧化氢渗漏到细胞质中，诱导活性氧的产生和一系列的凋亡和刺激反应。在对糖尿病模型的研究中发现，CHOP的缺失可以抑制胰腺β细胞的凋亡，并阻止Ero1-α的降低，从而降低一些氧化应激标记物和抗氧化基因的表达。此外，CHOP的过度表达可导致细胞周期阻滞，导致细胞凋亡；同时，CHOP诱导的细胞凋亡也可以通过抑制细胞周期调节蛋白p21的表达而触发细胞死亡[7]。

3.2 Caspase-12在ERS介导细胞凋亡中的作用

Caspase-12定位于内质网外膜，是ERS特有的凋亡蛋白，是caspase家族中第一个与ER相关的成员，在ERS时被切割和特异激活，只定位于内质网且只能在内质网启动凋亡途径时被激活，caspase-12的激活是ERS介导细胞凋亡的关键下游执行分子，caspase-12的激活将进一步通过裂解并激活 caspase-9，触发细胞质caspase-3的激活，并最终触发细胞凋亡。研究表明，caspase-12缺陷的细胞在ERS诱导剂如衣霉素诱导时细胞凋亡减少，caspase-12只有在内质网应对诱导刺激的反应中特异性地激活并引起细胞凋亡[8]。正常情况下，内质网内的caspase-12 以无活性的形式存在，只有在 ERS 条件下，如Ca2+失衡和未折叠蛋白集聚时被激活。ERS可通过钙激活蛋白酶 Calpains和 TRAF2 依赖性机制激活 caspase-12，在正常情况下，TRAF2与procaspase-12形成稳定的复合物，内质网应激发生时caspase-12与TRAF2解离并活化，活化的caspase-12启动下游凋亡途径[9]。

4 ERS介导的细胞凋亡与急性肺损伤

4.1 脓毒症急性肺损伤 各种因素导致机体发生脓毒症时，肺脏是最易受累器官之一，常在发病早期就出现急性肺损伤，甚至急性呼吸窘迫综合征，病死率较高。研究发现，经大鼠尾静脉注射脂多糖建立急性肺损伤模型，脂多糖诱导后大鼠肺脏早期即有GRP78蛋白表达水平上调，可能提示在ALI发生早期，肺组织细胞内就已发生ERS；在脂多糖诱导后6h观察到CHOP蛋白表达水平明显升高；大鼠肺组织表达caspase-12蛋白的水平随着时间逐渐升高[10]。Kim等[11]的研究表明，脓毒症时ERS可能通过NF-κB/HIF-1α信号通路调节肺细胞凋亡，从而影响肺损伤的程度。另一项研究发现，经气管内滴注5mg/kg脂多糖24h后肺组织CHOP、caspase-12基因及蛋白表达水平明显增多，细胞凋亡增加；同样体外利用脂多糖刺激肺泡上皮细胞，也发现CHOP、caspase-12蛋白表达水平明显升高[1]。这些研究可能提示ERS介导的细胞凋亡参与脓毒症急性肺损伤的发病过程。

4.2 呼吸机相关性肺损伤 机械通气是全身麻醉的必要环节，也是治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的重要措施之一，但如果使用时间较长或参数设置不当，可能会导致或加重肺组织的损伤，称为呼吸机相关性肺损伤，常表现为肺水肿和低氧血症，发病机制与炎症反应和活性氧（ROS）增加等有关。Ye等[12]研究发现，给与高潮气量（20ml/kg）通气4h的小鼠比自主呼吸和低潮气量（7ml/kg）通气的小鼠表现出更严重的肺水肿和炎症反应；此外，高潮气量通气后大鼠肺组织内质网应激标志物GRP78、CHOP、p-IRE1、TRAF2和p-NF-κB的mRNA和蛋白表达均上调；内质网应激诱导剂毒胡萝卜素可加重高潮气量通气后小鼠肺组织学改变、炎症反应及GRP78和CHOP的表达，而内质网应激和IRE1α激酶抑制剂治疗可减轻肺组织病理损伤，并下调GRP78、CHOP、p-IRE1α、TRAF2和p-NF-κB的表达，提示内质网应激可能通过IRE1α/TRAF2/NF-κB信号通路参与呼吸机相关性肺损伤的发生。Piao等[2]的研究也表明，内质网应激参与高潮气量（30ml/kg）通气导致SD大鼠肺损伤的发生，内质网应激抑制剂4-苯基丁酸通过抑制内质网应激减少肺外泌体的释放，减少PERK和Toll-样受体4的表达，从而减轻机械通气导致的小鼠肺损伤。另一项研究发现，肺泡上皮细胞在周期性机械牵张力的作用下细胞凋亡增多，PERK/ATF4/CHOP通路的激活可能参与其中[13]。

4.3 海水吸入性肺损伤 海水被吸入肺部后可直接作用于肺泡上皮细胞和肺毛细血管上皮细胞引起损伤，导致肺泡出血渗出、肺间质水肿和通气/血流比例失调，肺脏气体交换功能常严重受损，最终导致急性肺损伤，患者出现低氧血症，严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征。Li等[14]的在体和离体研究发现，海水诱导大鼠肺泡上皮细胞凋亡的发生和肺组织病理改变，海水暴露还上调了内质网应激中的关键蛋白GRP78和凋亡蛋白CHOP的表达水平，表明可能激活了内质网应激介导的细胞凋亡；此外，应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸阻断内质网应激可显著改善海水诱导的细胞凋亡和组织病理学改变，而内质网应激诱导剂毒胡萝卜素则有相反的作用，表明内质网应激途径参与海水诱导肺泡上皮细胞凋亡的发生。

4.4 高氧性肺损伤 高氧性肺损伤是氧疗患者面临的主要临床问题,多发生于新生儿，发病机制复杂且尚不十分明确，目前认为可能主要与氧化应激反应、细胞凋亡等有关，内质网应激介导的细胞凋亡可能也发挥了重要作用。Teng等[15]的研究通过构建新生大鼠高氧肺损伤模型以模拟临床上新生儿长期暴露于高氧致肺损伤，发现暴露于高氧可以增加大鼠肺组织内质网应激标志蛋白GRP78、PERK、IRE1α、ATF6和凋亡蛋白CHOP的表达水平。另一项研究发现，大鼠在氧舱中连续暴露60h后CHOP、GRP78和XBP1的表达增加，出现肺水肿和细胞凋亡增多；而氢气可通过上调SIRT1减轻内质网应激介导的细胞凋亡，减轻高氧导致的大鼠急性肺损伤[16]。

4.5 其它脏器缺血再灌注诱发的急性肺损伤 心脏、肝脏、肾脏、肢体等发生缺血再灌注时常可导致远隔器官损伤，肺脏是最易受累器官之一，发病机制与炎性因子大量释放、氧化应激等有关，内质网应激可能也参与其发病过程。Huang等[17]在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注诱导急性肺损伤模型中发现，结扎大鼠左冠状动脉造成缺血1h、再灌注1h后大鼠肺损伤评分、湿/干重比增加，PaO2降低。此外，心肌缺血再灌注后肺组织内质网应激的关键蛋白p-PERK、p-IRE1ɑ和ATF6的表达增加，细胞凋亡增多。Hu等[18]研究表明，肠缺血再灌注后，从肺泡灌洗液收集的中性粒细胞中观察到内质网应激增强，内质网应激诱导中性粒细胞释放颗粒并导致急性肺损伤，而抑制中性粒细胞中的内质网应激可显著缓解急性肺损伤。针对肢体缺血再灌注诱发肺损伤的研究发现，夹闭兔股动脉3 h、再灌注4 h后肺组织损伤评分、肺组织凋亡率升高，且GRP78、CHOP及caspase-12表达水平上调，说明内质网应激介导的细胞凋亡可能参与肢体缺血再灌注诱发肺损伤的发病过程[19]。

5 小结

近年来，随着对ERS及急性肺损伤的不断深入研究，越来越多的证据表明，ERS及ERS介导的细胞凋亡参与多种因素导致的急性肺损伤的发病过程，对其的调控可能是防治急性肺损伤的又一思路，但ERS参与急性肺损伤的具体机制尚未完全阐明，相关研究成果很少能应用于临床，需要深入的机制研究和转化。