影响核桃粕蛋白溶出率的提取条件

刘猛，李祥，樊凤娇

1. 吕梁学院生命科学系（吕梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（吕梁 033000）；3. 南京财经大学食品科学与工程学院（南京 210023）

现代科学研究表明，核桃对人的颅脑神经具有很好的保健功能。一直以来，人们由于只重视其健康价值和核桃油方面的研究，而忽略在脱脂核桃蛋白的利用率等方面的研究[1]。由于核桃富含多种矿物质元素，具有丰富的营养价值，可以起到增强大脑记忆力的作用[2]。我国核桃产量最近几年也一直呈线性增长趋势，关于核桃产品的研发与利用逐渐成为市场和企业热点[3]。珠娜等[4]、余永婷等[5]、刘刚等[6]对于核桃蛋白以及相关蛋白开展深入研究；在国内关于核桃蛋白质研究方面的报道比较少，尤其是对核桃蛋白功能研究方面更是罕见[7]。Gu等[8]、Xu等[9]对核桃蛋白肽对于人和动物生命活动开展深入研究。核桃蛋白中有大量的谷蛋白，脱脂核桃粉可用于啤酒酵母发酵[10]，溶解性极差，一般采用高速剪切进行处理核桃[11]，因此很难将核桃相关产品应用于在乳饮料中[12]。核桃蛋白功能特性方面的研究，在对蛋白质溶解度的探究方面相对集中[13]。由此，试验探究不同加工条件下核桃蛋白质溶出率变化，对核桃蛋白的加工与应用提供技术支撑[14]。核桃乳饮料[15]中含有适量维生素、蛋白质、烟酸和其他微量元素，并且含有核桃独有的产品风味[16]。经常食用核桃相关产品，可以增强体魄、滋补颅脑神经、提高免疫能力[17]。与其他饮料相比，对铁、钙吸收较差的人群有较理想的改善效果[18]。

这几年，关于核桃分离蛋白特性的研究较多，核桃浓缩蛋白和分离蛋白产品没有产业化、模式化，核桃蛋白分离纯化，通常使用酸沉碱提法或者联用一些辅助设备进行蛋白提取[19]。由于一些壳和皮没有被去除干净，因此榨取核桃油时，使获得的核桃粕中带有杂质，从而影响到蛋白质的结构及一些功能特性，而且提取率偏低，有比较严重的蛋白损失和浪费[20]。然而，有尚未应用于核桃蛋白的制备方法如基于乙醇浸渍法浓缩的蛋白质[21]，其未使用的主要原因是核桃油和蛋白质的利用率不能形成产业链，导致一定杂物残留，乙醇浸渍法的应用因核桃皮被限制[22]。核桃蛋白作为一种优质的植物蛋白资源，使核桃蛋白在工业生产和新产品的研发中，为社会创造更多的价值[23]。

试验为探究核桃蛋白质溶出率的影响因素，设置不同加工条件，采用单因素试验法，结合正交试验分析，得出酸沉碱提法分离蛋白的最佳加工条件，为扩大核桃分离蛋白在食品行业的应用，支撑核桃饮料及其核桃功能产品研发。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

核桃饼粕；石油醚（分析纯，北京宏宇化学试剂公司）；硫酸铜、硫酸钾、硼酸溶液、甲基红-亚甲基蓝指示剂（均为分析纯，上海鸥科蜜化学试剂有限公司）；BCA试剂盒（生化试剂，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

PHBJ-260 pH计（上海东方科学仪器股份有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；SC-04离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SP21-318C酶标仪（北京中西远大科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃粕的预处理

使用粉碎机把核桃饼粕粉碎至粉末状。

1.3.2 核桃蛋白的分离纯化

采用酸沉碱提法分离纯化核桃蛋白质。工艺流程：称取适量核桃饼粕，以一定比例将其与蒸馏水进行混合，用氢氧化钠溶液进行样品pH调节，设置3 000 r/min离心机转速，进行10 min的离心操作，为调节pH至等电点将上层清液进行加酸操作，再次进行离心，核桃蛋白经沉淀干燥后在下层。

1.3.3 蛋白质含量的测定

通过凯氏定氮法进行核桃总蛋白质含量的测定，蛋白质含量按式（1）计算。

式中：X为食品中蛋白质的含量，g/100 g；V为滴定试样每消耗0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，mL；V0为空白试验时每消耗0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，mL；c为盐酸标准滴定溶液的物质量浓度，mol/L；0.014为1 mL物质的量为1 mol/L盐酸标准滴定溶液等价于氮的质量，g；m为试样的质量，g；F为氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25。

1.3.4 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）测蛋白质浓度[24]

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.4 单因素试验

1.4.1 不同pH条件处理

碱液浸提核桃蛋白过程，通过调节核桃蛋白样品的pH控制体系变量。准确称取2 g核桃饼粕，与蒸馏水以料液比1∶15（g/mL）混合，室温下充分混匀搅拌。调节溶液的pH分别为7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，进行60 min的搅拌，进行时长30 min、温度60℃的热处理，以室温为标准冷却，进行提取核桃饼粕蛋白的操作，研究pH对核桃蛋白溶出率的影响。

1.4.2 不同浸提时间处理

碱液浸提核桃蛋白过程中，通过控制核桃蛋白样品的时间控制体系变量。准确称取2 g核桃饼粕，与蒸馏水以料液比1∶15（g/mL）混合，室温下充分混匀搅拌。调节溶液的pH为7.0，分别浸提30，45，60，75和90 min，在60 ℃的温度下进行30 min预处理，以室温为标准进行冷却，提取核桃饼粕蛋白，研究浸提时间对核桃饼粕蛋白溶出率影响情况。

1.4.3 不同浸提温度处理

碱液浸提核桃蛋白过程中，通过控制碱液浸提的温度，来控制体系变量。准确称取2 g核桃饼粕，与蒸馏水以料液比1∶15（g/mL）混合，室温下充分混匀搅拌。调节溶液的pH 7.0为搅拌，搅拌60 min。分别在温度20，40，60，80和100 ℃下热处理30 min，冷却至室温，进行提取核桃饼粕蛋白的操作，研究浸提温度对核桃饼粕蛋白溶出率影响情况。

1.4.4 不同料液比处理

碱液浸提核桃蛋白过程中，改变样品与蒸馏水比例控制体系条件的改变。准确称取2 g核桃饼粕，体系的温度控制在60 ℃，确保浸提时间60 min，pH 7.0，设置5个料液比水平（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL），进行提取核桃饼粕蛋白的操作，研究料液比对核桃饼粕蛋白溶出率的影响情况。

1.4.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，以pH、料液比、温度和时间为因素进行四因素三水平正交试验设计，以核桃蛋白质溶出率为指标，对结果进行分析处理。

1.4.6 核桃蛋白质溶出率的计算

将经过不同条件处理的核桃饼粕样品，经过酸沉碱提工艺处理后，将上层清液取出，通过酶标仪法测定可溶性蛋白质的含量，蛋白质溶出率按式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 蛋白质总含量的测定

通过凯氏定氮法测定蛋白质的总蛋白质含量，核桃粕中蛋白质含量为70%，与相关文献中所得出的蛋白质含量对比可得出，试验所使用的核桃粕有较高的蛋白质含量

2.2 蛋白质标准曲线

蛋白质标准曲线如图1所示。通过BCA法测定得到的蛋白质浓度标准曲线为y=0.897 37x+0.078 46（R2=0.996 78），蛋白质浓度由回归方程计算。

图1 蛋白质标准曲线

2.3 单因素试验结果分析

2.3.1 pH对核桃蛋白质溶出率的影响

由图2可知：随着pH变大，核桃蛋白质溶出率呈现先上升后下降趋势，核桃蛋白质溶出率达到峰值72.25%，此时的pH为10.0；pH 11时，其溶出率为70.12%。因此，选取pH 9.0，10.0和11.0进行正交试验。

图2 pH对溶出率的影响

2.3.2 浸提时间对核桃蛋白质溶出率的影响

浸提时间对核桃蛋白质溶出率结果的影响曲线图如图3所示。不同时间时，其核桃蛋白质溶出率分别为8.56%，9.08%，9.13%，9.12%和9.11%。随着浸提时间的增加，核桃蛋白溶出率逐渐增加，达到60 min时，增加趋于平缓。所以，选取浸提时间45，60和75 min进行正交试验。

图3 时间对溶出率的影响

2.3.3 温度对核桃蛋白质溶出率的影响

浸提温度对核桃蛋白质溶出率的影响结果曲线图如图4所示。核桃蛋白质在取不同温度时的溶出率分别为6.05%，7.95%，9.08%，8.76%和8.56%。浸提温度达到60 ℃时，核桃蛋白溶出率最高，且随着温度的升高，变化趋于平缓。因此，选取温度40，60和80 ℃进行正交试验。

图4 温度对溶出率的影响

2.3.4 料液比对核桃蛋白质溶出率的影响

料液比对核桃蛋白质溶出率的影响结果曲线图如图5所示。核桃蛋白质在取不同料液比时的溶出率分别为8.96%，9.11%，9.08%，9.07%和9.07%。当料液比达到1∶15（g/mL）时，核桃蛋白溶出率达到最大，且随着料液比的继续增加，核桃蛋白溶出率有所下降且趋于平缓。因此在选择正交试验因素水平时，选取的水平为1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）。

图5 料液比对溶出率的影响

2.4 正交试验结果

通过单因素试验筛选出对核桃蛋白质溶出率的影响较大的4个因素：pH、温度、时间、料液比（分别以A、B、C、D表示）。选取这4个因素为自变量，以蛋白质溶出率为指标，进行四因素三水平正交试验，每个试验因素选取水平见表1，通过试验所得正交试验结果见表2。

表1 因素与水平表

表2 L9(34)方案及结果分析

从极差分析结果可以看出，RA＞RD＞RB＞RC，即对核桃蛋白质溶出率的影响因素主次所产生影响的顺序为pH＞料液比＞温度＞时间。通过比较得到最优方案为A2B3C1D2，即pH 10.0、温度80 ℃、时间45 min、料液比1∶15（g/mL），经过试验得到该条件下核桃蛋白质的溶出率为70.87%。

3 结论

以核桃饼粕为原料，采用酸沉浸提法分离核桃蛋白，通过单因素试验，研究不同pH、温度、时间、料液比水平大小对核桃蛋白质溶出率的影响情况，根据正交试验结果，探究核桃蛋白提取的最佳工艺条件。酸沉碱提工艺在通过正交试验后确定的最优条件为pH 10.0、温度80 ℃、时间45 min、料液比1∶15（g/mL），在该工艺下的核桃蛋白质溶出率最高，溶出率为70.87%。