2020年ATC肾移植相关基础与转化医学研究国际前沿热点

何健楠 孙启全

2020年美国移植年会（American Transplant Congress，ATC）于2020年5月30日至6月1日以线上会议形式举行，主题为“明天的科学始于今天”（The Science of Tomorrow Starts Today）。本次会议内容丰富，涉及移植相关的各个领域，重磅报道众多，展示了移植临床、基础研究及转化医学的新思路、新技术与新进展。本文摘取了本次会议中肾移植相关的重点报道，就其中基础与转化医学研究的国际前沿热点和新进展作一综述。

1 免疫记忆

免疫记忆被认为是适应性免疫的一种特征，在免疫反应中，初始T细胞和B细胞转化为记忆表型，为机体提供长期的保护。记忆性细胞在保护性免疫中不可或缺，但在移植中却是一个独特的挑战。一方面，记忆性细胞能够抵御病原体入侵，降低机体感染的风险；而另一方面，供体反应性的记忆性细胞会影响移植物的存活，并导致移植物丢失。记忆性细胞的两面性在移植物存活管理中形成了治疗的难点。随着研究的深入，人们对记忆性细胞的认识正在不断演变。

1.1 组织定居型记忆性T细胞

记忆性细胞虽然是由血液循环中的初始细胞和效应性细胞分化形成，但部分细胞在局部组织中成熟后可驻留在局部，成为定居型细胞，其位置和功能受局部特定环境调节。因此，对移植物局部的记忆性细胞进行探索和处理，将能避免全身性消除记忆性细胞所带来的风险。组织定居型记忆性T细胞（tissue resident memory T cell，TRM）在功能、转录和表型上都不同于循环效应性T细胞和中央记忆性T细胞。现在普遍认为TRM在局部组织中起到了重要的免疫监视和应对感染的作用[1-2]。而TRM在移植中的作用尚不清楚。

美国匹兹堡大学Abou-Daya等[3]利用小鼠肾移植模型，探索了TRM在移植中的作用。研究者首先将同基因B6小鼠和异基因（B6×Balb/c）F1.ova小鼠的肾脏分别移植给B6受体小鼠，第2 日予输注100万的OT-I效应性T细胞。移植术后测定血清肌酐的变化，在第4周和第8周取移植物、血液、骨髓等组织进行分析。剔除带有体内标记的T细胞后，TRM的表型确定为CD44highCD62LlowCD69+CD103+/-细胞。结果显示，异基因组小鼠的平均血清肌酐水平高于同基因组，异基因组移植物的组织学表现为急性和慢性混合性排斥反应。流式细胞术分析发现上述表型的TRM存在于OT-I效应性T细胞和内源性T细胞中。

为了进一步证明TRM的定居特性，研究者将移植术后4周的CD45.1 B6小鼠（含OT-I效应性T细胞）和接受了F1.ova供肾的CD45.2 B6小鼠（不含OT-I效应性T细胞）进行联体共生实验（通过联体手术使得两只小鼠形成血液、体液交互）。然而OT-I效应性T细胞在共生鼠的移植肾和血液循环中均未检测到，说明TRM确实只是定居在移植物中而不会进入血液循环。

最后，为验证TRM是否足以引起排斥反应，研究者在再次移植模型中，使用切除脾脏的LTBR-/-小鼠作为含有TRM的F1.ova肾脏的二级受体。为了进一步确定定居型OT-I效应性T细胞（TRM）和排斥反应之间的因果关系，实验组在移植术后第4周使用Thy1.1单克隆抗体将OT-I效应性T细胞耗尽，其排斥反应明显弱于未使用Thy1.1单克隆抗体组。这项研究说明了供体特异性的TRM具有效应功能，而且在排斥反应中发挥了重要作用。

1.2 记忆性细胞的调节功能及抑制性受体

记忆性细胞并非任何时候都持续执行其记忆功能，在某些移植模型中，研究者发现记忆性细胞中的亚群显示出调节性细胞的功能，促进了移植物的生存，这与其本来定义的功能恰恰相反[4-5]。由此说明，记忆性细胞的功能并不是单向的，其在不同条件下会发生改变。为了寻找移植术后调控记忆性T细胞功能的新途径，美国埃默里大学Morris等[6]对倾向于免疫耐受及倾向于免疫排斥的两组CD8+记忆性T细胞群体进行了高维免疫表型分析。FcγRⅡB是一种抑制性IgG受体，既往认为FcγRⅡB仅表达于B细胞和初始免疫细胞表面。研究者发现在同种免疫反应过程中，FcγRⅡB亦可表达于CD44highCD8+记忆性T细胞表面。FcγRⅡB在CD8+记忆性T细胞上的表达水平与皮肤移植动物模型中的受体中位存活时间呈正相关，且与共刺激阻断治疗相关。与野生型小鼠相比，当敲除移植物CD8+记忆性T细胞的FcγRⅡB基因后，即使给予共刺激阻断治疗，皮肤移植小鼠仍出现加速性排斥反应。该研究表明，在异基因免疫应答过程中，FcγRⅡB是CD8+记忆性T细胞免疫应答的负调节因子，提示针对该通路的靶向治疗可改善致敏个体的移植结局。

1.3 天然免疫细胞的记忆功能

已有研究表明某些类型的先天性免疫细胞，如自然杀伤（natural killer，NK）细胞和巨噬细胞，也可获得记忆特性，从而强化免疫记忆反应[7-8]。最近的一项研究中，Dai等[9]报道了一个颠覆性的发现——天然免疫细胞具有抗原特异性记忆功能。研究者发现小鼠单核细胞和巨噬细胞获得了针对主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ抗原的特异性记忆反应，并明确A型配对免疫球蛋白样受体（paired immunoglobulin-like receptor A，PIR-A）是记忆反应所必需的。敲除受体体内的PIR-A或阻断PIR-A与供体MHCⅠ结合，均可阻断记忆反应，并减弱肾移植和心脏移植的排斥反应。因此，先天性免疫细胞的同种异体抗原特异性记忆反应将是进一步改善移植物存活的重要靶点。

2 排斥反应和免疫耐受

2.1 CD11b与CD154的相互作用

T细胞针对外来抗原产生有效免疫应答需要2种不同的分子信号：一是由抗原特异性T细胞受体（T cell receptor，TCR）与抗原提呈细胞上的MHC-抗原肽复合物结合提供的第一信号；二是由共刺激分子参与传递的第二信号。在已发现的对排斥反应起关键作用的多种协同刺激通路中，CD40-CD154是最具特征的信号通路之一[10]。数十年来，阻断CD40-CD154共刺激通路，被认为是抑制T细胞应答反应的有效方法，可提高小鼠及非人灵长类哺乳动物的移植物存活率，但抗CD154单克隆抗体的血栓栓塞并发症阻碍了其临床应用，并促使产生靶向CD40的药物作为替代治疗[11]。然而，抗CD40单克隆抗体在提高移植物存活率方面不如抗CD154单克隆抗体，提示CD154可能与另一受体相结合从而发挥作用。Liu等[12]研究发现CD11b很可能担当了这一重要角色。研究者通过对照研究发现，在野生型和CD40-/-受体小鼠中，使用抗CD154单克隆抗体均可显著减少移植物CD8+T细胞浸润，表明CD154的作用不依赖于CD40。研究者进一步使用了一种特定的肽拮抗剂，可以阻断CD154与CD11b的结合，但对CD154和CD40的相互作用没有影响。结果显示，与单独使用抗CD40单克隆抗体相比，阻断CD154与CD11b的结合显著增强了抗CD40单克隆抗体在提高移植物存活率方面的效果，并减少了移植物CD8+T细胞浸润，其效果与抗CD154单克隆抗体相当。这些数据表明，CD11b很可能正是CD154的另一受体。因此，了解CD154和CD11b的相互作用及其影响，并进行临床转化应用，对改善目前临床上抗CD40单克隆抗体的治疗效果有着非常重要的意义。

2.2 重组促红细胞生成素在诱导移植免疫耐受中的作用

在诱导移植免疫耐受的转化研究方面，美国和德国的研究者利用灵长类动物进行了尝试。先前的研究表明，使用重组促红细胞生成素（recombinant erythropoietin，rEPO）进行治疗，可以延长小鼠心脏移植物的存活时间，其机制与调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的增殖有关。Ahrens等[13]首次在MHC完全错配的食蟹猴心脏移植模型中，使用高剂量促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）和抗CD8单克隆抗体治疗后，成功诱导免疫耐受。这些数据为进一步研究EPO和抗CD8单克隆抗体治疗对移植物存活时间的影响提供了基础。

3 异种移植

同种移植已经在临床上广泛应用，而目前用于移植的供者器官主要来源于公民逝世后器官捐献，远远不能满足终末期器官衰竭患者的需求，而异种移植有望开辟新的器官来源途径。随着基因编辑技术的发展，经过多基因编辑的猪有望成为器官供体[14]。器官供体猪的基因改造工程主要涉及2个方面：（1）敲除猪的3个关键抗原中的1个或多个基因；（2）插入人类转基因，以保护器官免受人类补体或凝血活动的影响[15]。随着新技术的出现（如CRISPR-Cas9），在猪体内实现多基因操作变得越来越容易，成本也越来越低，从而加速了该技术在临床应用方面的进展[14]。

本次ATC报道了一项相关的最新研究成果，研究者尝试将经过三基因敲除及插入的基因编辑猪的肾脏移植给食蟹猴，观察其存活情况。所有供体猪均被敲除三联抗原基因，并在3种变异猪体内表达不同水平的人类补体、凝血和免疫调节转基因。移植术后受体接受单克隆抗体的诱导治疗，并使用抗CD154单克隆抗体、吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）、甲泼尼龙和西罗莫司进行维持治疗。随后对受体进行临床随访，随访项目包括实验室检查、超声检查和常规活组织检查（活检）等。其中存活时间最长的受体在移植术后237 d活检时无排斥反应，而在术后265 d死于继发性难治性贫血[16]。此前报道的基因编辑猪肾脏移植给灵长类动物的异种肾移植受体最长存活时间为125 d[17]。通过敲除异种抗原基因和插入人类转基因的基因修饰，异种肾移植受体的存活时间得到了很大的提高，这为进一步的研究和临床转化带来了希望。

4 抗体介导的排斥反应

在过去的30年中，免疫抑制剂的使用已显著降低T细胞介导的急性排斥反应的发生率，但移植物的长期存活改善甚微。研究认为，抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）是晚期移植物丢失的主要原因之一[18]。目前临床尚无经批准可明确有效治疗AMR的药物，因此，相关药物的研发和临床转化显得尤为迫切。

补体是导致炎症反应和移植物损伤的主要因素，在缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）、移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）及急、慢性AMR的发生发展过程中尤其重要。C1抑制剂（C1 inhibitor，C1-INH）在发挥其抑制炎症和抗移植物损伤作用的同时，保留了旁路途径和膜攻击复合物（C5-9），因此机体的天然抗菌防御功能保持不变，保障了机体安全。来自动物和体外实验的大量数据表明，C1-INH可改善IRI和慢性AMR[19]。为促进C1-INH在移植中的临床转化，来自美国和新西兰的研究者Blanton等[20]通过灵长类动物实验，证实了使用重组人C1-INH（recombinant human C1-INH，rhC1-INH）可有效减少AMR的发生。研究者通过使用猕猴脑死亡供体模型发现，与单纯供体或受体治疗相比，供、受体接受rhC1-INH的双重干预后，受体的肾功能恢复更快，无AMR生存率更高。该研究表明，供、受者双重干预的rhC1-INH治疗方法是预防肾移植术后DGF和降低AMR发生率的一种新策略，有望应用于临床试验。

5 纳米医学

纳米凝胶是一种纳米级别的聚合物纳米颗粒，通过聚合物链交联形成三维网络，能够封装生物活性材料，如低分子量药物、蛋白质、核酸等[21]。在热、光、酸、碱等外部刺激下，网络结构的改变或凝胶相的转变可以使封装的材料从纳米凝胶中释放出来。将蛋白质有效地输送到靶向部位或特定细胞，长期控制其释放，并确保其在体内的稳定性，这对于用作治疗疾病的蛋白质类生物制剂来说至关重要[22]。目前纳米凝胶在移植中鲜有应用，美国、英国和荷兰的研究者进行了白细胞介素（interleukin，IL）-2纳米凝胶的尝试[23]。动物体内实验表明，体外扩增的Treg过继输注在自身免疫和同种免疫方面具有巨大潜力，但Treg疗法在临床转化应用上进展缓慢，主要原因是Treg的内稳态需要持续的TCR配体和IL-2来维持。研究者曾尝试通过注射低剂量的IL-2来增加内源性Treg的反应性，然而全身性应用IL-2会导致细胞毒T淋巴细胞和NK细胞的活化，从而造成不良后果。通过利用纳米凝胶技术，研究者构建了IL-2纳米凝胶工程化Treg，从而维持抗原接触部位的细胞数量。纳米凝胶与IL-2形成纳米颗粒，可持续释放IL-2。IL-2纳米凝胶工程化的免疫调节性CD4+CD25+Foxp3+T细胞通过抗原-TCR的相互作用，为Treg在抗原富集区（移植物或移植物淋巴结引流区）的过继输注提供了细胞因子所介导的生存环境。结果显示，IL-2纳米凝胶工程化的Treg可以大大提高移植物存活率。

6 排斥反应的分子学信号

6.1 移植肾损伤分子标志物

为寻找更加合适的用于评估移植肾损伤以及预测术后移植物长期存活的分子标志物，欧洲多家中心的研究者对移植受者单核细胞源性微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）进行了定量检测[24]。结果发现血液中有14种miRNA与AMR相关，在发生AMR的受者中表达下调；生物统计分析显示，3种miRNA（miR-15b、miR-106a、miR-374a）可作为AMR的最佳分子标志物；miRNA与临床生物化学指标相结合可提高移植肾AMR的诊断准确性。该研究为miRNA作为移植肾损伤分子标志物及其在AMR中发挥的关键作用提供了新的见解。

6.2 单细胞RNA测序评估移植肾疾病

单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项新技术[25]。其原理是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序。scRNA-seq可以识别罕见细胞类型、新细胞状态和细胞间信号通路，为复杂的生物系统提供了新的探索策略，逐渐被应用到各种复杂疾病的研究中[26]。在器官移植中移植物细胞类型多样，因此scRNA-seq的应用尤为必要[27]。

肾移植术后肾小球疾病的发生率较高，其发病机制目前无法用免疫机制解释。肾小球内皮细胞损伤可能与肾小球疾病的发生和发展有关。美国密歇根大学的Naik等[28]通过scRNA-seq评估移植肾肾小球内皮细胞表达产物的动态变化，以揭示肾小球疾病发生发展的机制。研究者在活体供肾移植物再灌注前、术后3个月及术后12个月时进行活检，并通过scRNA-seq评估肾小球内皮细胞的活化状态。差异表达基因分析显示，在术后不同时间段，与细胞-细胞黏附、细胞-基质黏附、血管生成及生长因子相关的基因表达存在差异，这可能会导致平滑肌细胞与成纤维细胞的增殖。可见，在移植物肾组织尚未出现结构损伤时，肾小球内皮细胞的基因表达已经发生改变。

7 小 结

总体而言，移植免疫在肾移植基础研究中仍然占据着主导地位，通过移植模型来探索免疫新机制体现了移植研究在人类医学发展中的重要意义，其中对于免疫记忆的颠覆性发现更是具有里程碑式的意义。AMR是近几十年来一直困扰着移植研究者和临床医师的难题，尽管举步维艰，但每一点新的突破都值得期待，同时研究者要拓宽角度、多管齐下，利用新技术和跨学科研究突破重围。基因编辑技术的发展推动异种移植迈进了新里程，而如何实现同种异体移植完全免疫耐受仍需不懈的探索。