针灸联合药物治疗对肠易激综合征大鼠脑-肠轴失衡的作用研究*

杨 敏， 邹 燃， 邓 薇， 徐派的， 李 悦

（武汉市中西医结合医院针灸科，湖北武汉430022）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种非常普遍的功能性肠胃道疾病，影响着10%～15%人群的健康，且一般药物的治疗效果甚微，对医疗费用造成了巨大的经济负担［1-2］。研究表明IBS 与头痛、慢性疼痛、糖尿病及失眠和嗜睡相关症状的患病几率相关［3］。IBS 可分为 4 种亚型：腹泻型、便秘型、混合型和不定型，其症状归属于中医“腹痛”、“泄泻”范畴［4］。IBS 的治疗主要包括两种：药物治疗和非药物治疗，药物治疗以缓解临床症状为主，但无法根治此病，非药物治疗亦可缓解患者的临床症状，提高生活质量，非药物疗法包括运动疗法、饮食疗法和针灸疗法等［5］。脑-肠轴是连接肠胃道系统与中枢神经系统的神经内分泌网络，其参与了IBS 的发病机制［6］。相关研究结果显示，以“天枢”、“内关”穴进行电针可明显改善IBS 大鼠的结肠动力异常症状［7］。本研究采用取内关、天枢和太冲穴位电针，联合药物治疗IBS 大鼠，观察疗效，并探究针灸联合药物治疗对IBS 大鼠多种脑肠肽含量的影响，以期为选择IBS有效治疗方法提供依据。

材料和方法

1 动物

48 只 6 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠，体重（235±15）g，购自辽宁长生生物有限公司（合格证号No.1107262011000418，设施使用证号No.00200090。饲养温度为22～26 ℃，相对湿度为50%～60%，人工光照明暗各12 h。将大鼠分为对照组（n=9）和模型组（n=39），模型组构建IBS 模型，每组随机选择3 只大鼠用于鉴定模型是否构建成功。

2 药物与试剂

蒙脱石散（山东宏济堂制药集团股份有限公司，国药准字H20093638）；氟哌噻吨美利曲辛片（重庆圣华曦药业股份有限公司，国药准字H20153122）；戊巴比妥钠（Sigmamerck）；三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS；Sigma）；大鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA 试剂盒、大鼠神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）ELISA 试剂盒和大鼠降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）ELISA 试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）测试盒（南京建成生物工程研究所）；RIPA 裂解液（Gelatins）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（金客隆生物技术有限公司）；PVDF 膜（Doclab）；化学发光试剂（Rongbai）；5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）抗体（武汉贝茵莱生物科技有限公司）；5-羟色胺受体4（5-HT receptor 4，5-HTR4）抗体（CST）。

3 方法

3.1 IBS 模型构建 采用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将细塑料导管从大鼠肛门处导入至降结肠，大鼠头部向下垂直放置，于1 min 内缓慢灌注50 mg TNBS，灌注1 min 后将导管缓慢取出。对照组大鼠以相同的方法给予等体积的生理盐水灌注，均在1周后进行模型鉴定［8］。

3.2 模型鉴定 采用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取结肠组织，观察结肠溃疡和炎症情况。采用5-HT ELISA 试剂盒和MPO 测试盒分别检测大鼠结肠组织中5-HT浓度和MPO 活性，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

3.3 分组治疗 将IBS 造模成功的36 只大鼠随机分为6 组：模型（model）组、药物A（drug A）组（25 mg·kg-1·d-1蒙脱石散）、针灸（acupuncture）组、药物A+针灸组、药物 A+药物 B 组（25 mg·kg-1·d-1蒙脱石散+0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻吨美利曲辛片）和药物A+药物B+针灸组，每组6 只；剩余6 只正常大鼠为对照（control）组。药物A组：给予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脱石散灌胃，每天1次，连续治疗2周，药物剂量根据人临床用药量换算成大鼠用药剂量［9］。针灸组：将大鼠捆绑后，参照《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱定位，取大鼠内关、天枢、太冲穴位，每穴斜刺0.7 mm，穴位旁开5 mm 平刺，接电针（参数：疏密波，频率2～100 Hz，强度 0.1～0.2 mA）［10］，每天 1 次，每次 20 min，连续治疗2 周。药物A+针灸组：给予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脱石散灌胃，并以内关、天枢、太冲穴位电针，每天1次，连续治疗2周。药物A+药物B组：给予 大 鼠 25 mg·kg-1·d-1蒙 脱 石 散 灌 胃 和 0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻吨美利曲辛片灌胃，每天1 次，连续2周，药物剂量根据人临床用药量换算成大鼠用药剂量［11］。药物A+药物B+针灸组：给予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脱石散灌胃和 0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻吨美利曲辛片灌胃，并以内关、天枢、太冲穴位电针，每天1次，连续治疗2 周。对照组和模型组大鼠均灌胃生理盐水，每天1次，连续2周。治疗结束后，进行腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reaction，AWR）评分检测。采用100 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠致死，收集大鼠脑和结肠组织，保存备用。

3.4 AWR 评分检测 在PTCA 导管前段套上高顺应性的橡胶球囊，从肛门插入至距离肛口6 cm 处。通过给球囊充气加压，初始内压为20 mmHg，压力递增至80 mmHg，每个压力观察20 s，期间休息5 min。根据大鼠腹部回缩反射进行AWR 评分［12］：结肠扩张时大鼠无反应计为0 分；结肠扩张时大鼠身体静止不动，头部偶有扭动计为1 分；结肠扩张时腹部肌肉收缩，但未抬离桌面计为2 分；结肠扩张时腹部肌肉收缩并抬离桌面计为3 分；结肠扩张时腹部高离桌面，身体呈弓形计为4分。

3.5 甲苯胺蓝染色 收集各组大鼠结肠组织，浸蜡包埋，制成切片，脱蜡至水后，在切片上滴加甲苯胺蓝染色液，染色5 min。洗去染色液，加入1%冰醋酸分化，水洗终止反应。加入二甲苯逐级透明切片，中性树脂封片，于显微镜下观察切片组织中肥大细胞染色结果并拍照，细胞核染色呈浅蓝色，肥大细胞染色呈紫红色。

3.6 ELISA 检测 收集各组大鼠结肠组织，剪碎组织块，匀浆取上清液。根据ELISA 试剂盒说明书进行实验操作，检测各组大鼠结肠组织中NPY、CGRP、SERT、CHR和5-HTR4浓度。

3.7 Western blot 检测 收集各组大鼠脑组织，取20 mg 组织加入200 μL 裂解液，匀浆直至完全裂解，提取组织蛋白质。BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，SDS-PAGE 分离蛋白。将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。Ⅰ抗和膜室温孵育1 h，洗膜，加入Ⅱ抗，室温孵育1 h。洗膜，加入化学发光试剂，将膜置于分析仪中检测，读取蛋白条带灰度值。各Ⅰ抗稀释比均为1∶1 000。

4 统计学处理

所有数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用SPSS 23.0 进行单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 IBS模型鉴定

对照组大鼠结肠组织外观正常，肉眼未见溃疡与炎症部位；模型组大鼠结肠组织有多处溃疡与炎症部位。与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中5-HT 浓度显著升高（P＜0.05），MPO 活性也显著升高（P＜0.05），见图1。

Figure 1. IBS model identification. A：concentration of 5-HT in colon tissue of rats；B：activity of MPO in colon tissue of rats. Mean±SD. n=9.#P＜0.05 vs control group.图1 IBS模型鉴定

2 各组大鼠AWR评分比较

与对照组比较，模型组大鼠AWR 评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠AWR 评分显著降低（P＜0.05），见图2。

3 各组大鼠结肠组织肥大细胞观察结果

模型组大鼠结肠组织中出现大量呈紫红色的肥大细胞；比对照组大鼠结肠组织中肥大细胞多，经过针灸治疗后的大鼠结肠组织中肥大细胞少于模型组。经过蒙脱石散（药物A）和针灸治疗后，相较于单独的蒙脱石散或针灸治疗组，肥大细胞减少，而经过蒙脱石散（药物A）、氟哌噻吨美利曲辛片（药物B）和针灸联合治疗后的大鼠结肠组织中所检测出的肥大细胞更少，见图3。

4 各组大鼠结肠组织中SERT、5-HTR4、CHR、NPY和CGRP浓度比较

Figure 2. AWR score. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.图2 AWR评分

与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中NPY 和SERT 浓度显著降低（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CHR 的浓度显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠结肠组织中NPY 和SERT 浓度显著升高（P＜0.05），而CGRP、5-HTR4 和CRH 浓度显著降低（P＜0.05），且蒙脱石散（药物A）、氟哌噻吨美利曲辛片（药物B）和针灸联合治疗组大鼠结肠组织中NPY和SERT 浓度进一步升高（P＜0.05），CGRP、5-HTR4和CRH浓度进一步降低（P＜0.05），见图4。

5 各组大鼠脑组织中SERT、5-HTR4、CHR、NPY和CGRP蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组大鼠脑组织中NPY 和SERT 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CRH 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠脑组织中NPY和SERT蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CRH 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），且蒙脱石散（药物A）、氟哌噻吨美利曲辛片（药物B）和针灸联合治疗组效果更显著（P＜0.05），见图5。

讨 论

脑-肠轴学说在肠胃疾病发病机制中受到的关注越来越多，研究显示，脑-肠轴神经免疫内分泌功能紊乱在IBS发病机制中扮演重要角色，而电针治疗可使IBS 大鼠脑-肠轴神经免疫网络恢复到平衡水平［13］。5-HT 是一种激素和神经递质，调节神经活动以及心血管功能、肠道运动和血小板聚集等多种生理过程［14］。临床数据显示，IBS 患者的血浆 5-HT 水平显著高于健康者［15］，且 5-HT 水平与 IBS 患者腹部症状评分呈正相关，提示5-HT 含量异常可能参与了IBS患者临床症状的发生［16］。研究显示TNBS诱导的IBS 大鼠模型的内脏敏感性和MPO 含量增加，提示IBS 模型构建成功［17］。本研究亦采用 TNBS 诱导 IBS模型大鼠，显示大鼠结肠组织出现溃疡和炎症损伤现象，且5-HT 浓度和MPO 活性均显著升高，提示本研究成功获得IBS大鼠模型。

Figure 3. Toluidine blue staining was used to observe mast cells in rat colon tissues（scale bar=50 μm）. More mast cells in the colon tissues of model group than control group were observed，fewer mast cells in the colon tissues were found after acupuncture or drug treatment，and even fewer mast cells were detected in the colon tissues after combined treatment with drug A+drug B+acupuncture.图3 甲苯胺蓝染色观察大鼠结肠组织中的肥大细胞

Figure 4. Comparison of CGRP（A），NPY（B），5-HTR4（C），SERT（D）and CRH（E）concentrations in colonic tissues of rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.图4 各组大鼠结肠组织中SERT、5-HTR4、CRH、NPY和CGRP浓度比较

针灸是中医学的重要组成部分，相较于西药、中药治疗，具有操作简单、耗费低、疗效确切和无毒副作用等优势［18］。阴阳平衡理论是中医基础理论体系的重要支柱，针灸治疗疾病在于调和机体阴阳，通过刺激穴位、经络以激发经气、扶正祛邪，从而促进机体发展为阴阳平衡的状态［19］。近年来诸多研究证实针灸治疗IBS 具有显著的疗效，本研究取IBS 大鼠天枢、内关和太冲穴电针，天枢为足阳明经要穴、大肠募穴，是脏腑经气输注和汇聚于胸腹部的腧穴，有理气调中，健脾和胃功效；内关为手厥阴经络穴，八脉交会穴，通于阴维脉，主治胃、心、胸疾病，有益心安神、理气和胃之功；太冲为足厥阴经输穴，可清热平肝，畅达气机。诸穴合用，可使脾阳得助，升清降浊，胃肠气机调畅，泄泻乃止；结果显示针灸治疗能够改善IBS 大鼠的脑-肠轴失衡，进一步证明针灸对治疗IBS具有一定的作用。

肥大细胞在导致脑-肠轴功能紊乱中起着重要作用，肥大细胞浸润与介质释放与IBS发病机制有关［20］，本研究也在IBS 大鼠的结肠组织中显示了大量的肥大细胞，且经针灸和药物治疗后，肥大细胞的数量显著减少。NPY、CGRP 和5-HT 等多种脑肠肽构成了脑-肠轴中各通路作用的物质基础，脑肠肽通过肠胃神经系统、中枢神经系统和肠胃道效应细胞三者间的信息传递发挥调节肠胃道的作用，而调节脑肠互动功能就是针灸治疗肠胃疾病的关键性效应机制［21］。我们检测了大鼠脑肠肽的含量，显示针灸与蒙脱石散、氟哌噻吨美利曲辛片单独或联合使用均能降低结肠组织中CGRP 的浓度及脑组织中5-HTR4 的表达，升高结肠组织中NPY的浓度，且针灸联合药物治疗的效果优于单独作用效果，表明针灸和两种药物对IBS大鼠脑-肠轴失衡具有调节作用。孙羽中等［22］研究显示IBS大鼠经过治疗后，脑组织中SERT的含量升高，认为升高SERT会再摄取大量的5-HT，从而维持机体5-HT 含量的正常水平，进而改善IBS 大鼠的症状。5-HT与其受体结合，可发挥收缩肠道的作用，进而参与IBS患者腹痛症状的发生［16］。本研究也同样显示经针灸和药物治疗后的IBS大鼠脑组织中的SERT含量显著升高，表明针灸和药物治疗能减轻IBS症状。

综上所述，针灸联合蒙脱石散和氟哌噻吨美利曲辛片治疗IBS大鼠，可有效改善大鼠脑-肠轴失衡，调节大鼠脑肠肽含量，减少肥大细胞浸润结肠组织。

Figure 5. Western blot was used to detect the expression of SERT，5-HTR4，CRH，NPY and CGRP in rat brain tissues. Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.图5 Western blot检测大鼠脑组织中SERT、5-HTR4、CRH、NPY和CGRP蛋白表达水平