丁苯酞软胶囊通过下调miR-137促进线粒体自噬对帕金森病大鼠发挥保护作用*

王文文， 邵彦江， 张新乐， 张金苹， 马 琪， 徐国卫

（1郑州市第七人民医院药学部，河南郑州450000；2郑州大学药学院，河南郑州450001；3郑州市第七人民医院神经内科，河南郑州450000；4郑州大学附属郑州中心医院神经内科，河南郑州450007）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种进行性运动障碍，由纹状体-黑质致密部中多巴胺能神经元逐渐丢失引起［1］。PD 的主要特征是运动功能障碍和其他非运动症状，如情绪和认知变化、自主神经功能障碍及睡眠障碍等；α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）的错误折叠和聚集、线粒体功能障碍、蛋白质清除受损、神经炎症和氧化应激［2-3］等是其主要的致病机制。自噬是线粒体清除受损的蛋白质或细胞器的主要途径，对于维持线粒体的自稳态以及细胞的存活至关重要，据报道线粒体和自噬障碍与PD 的发病机制有关，已被认为是PD治疗的潜在治疗靶标［4-5］。

丁苯酞（DL-3-n-butylphthalide，NBP）是神经内科常用的药物，具有保护线粒体功能、改善微循环、提高抗氧化酶活性及抑制神经细胞凋亡等多种神经保护作用［6-7］，其治疗 PD 效果良好，可安全有效地改善PD患者的运动和非运动症状［8-9］，但其作用机制尚不清楚。NBP 可通过提高泛素连接酶parkin 的泛素化活性促进线粒体自噬，改善阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）小鼠认知障碍［10］。微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类小的非编码RNA，它们在转录后水平上调节基因的表达。miR-137 能够靶向作用于多巴胺受体，参与多巴胺能神经元的增殖、凋亡和分化等反应［11］。近年来研究显示，miR-137 在PD 患者血液样本中高表达，并可能通过调控parkin 介导的线粒体自噬，参与 PD 的发生［12-13］。而NBP对PD的改善作用是否与miR-137介导的线粒体自噬有关，还未见相关报道。因此，本研究通过构建PD 大鼠模型，观察NBP 对PD 大鼠线粒体自噬的影响，并探讨其可能的作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雄性 SD 大鼠 120 只，7～8 周龄，体重200～230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为SCXK（京）2019-0009。将动物在受控的环境条件［环境温度（24±2）℃，湿度（55±5）%，光照12h/黑暗12 h］下饲养，自由饮水和摄食。研究已由机构动物护理和使用委员会批准，并遵循《实验动物的护理和使用指南》，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂及仪器 NBP 软胶囊（国药准字H20050299，石药集团恩必普药业有限公司，A14200036205，规格：0.1 g×24粒）；6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA；Sigma）；脑内miR-137 模拟物（Agomir-137）、阴性对照Agomir-NC 及miR-137引物序列均购自GenePharma；阿朴吗啡（apomorphine，APO；Sigma）；Trizol RNA 分离试剂及SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒均购自TaKaRa；组织线粒体分离试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 法）、RIPA 裂解液和BCA 试剂盒均购自碧云天生物科技公司；兔抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-Syn、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）A/B 和 PTEN 诱导假 定 激 酶 1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）、p62 和 β-actin 抗体，山羊抗兔 IgG H&L（HRP），小鼠抗大鼠parkin 抗体，以及兔抗小鼠IgG H&L（HRP）购自Abcam。

DB006-1型数显脑立体定位仪（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；大鼠疲劳转棒仪（UGO BASILE）；H-7500 型透射电子显微镜（HITACHI）；蛋白转膜装置（Bio-Rad）；BX61电动显微镜（Olympus）。

2 方法

2.1 模型制备与分组 大鼠适应性饲养7 d 后，参考文献方法采用6-OHDA 两点注射法制备PD 模型［14-15］。具体操作为：戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，取俯卧位，将头部固定于脑立体定位仪中，脱去颅顶毛发，碘伏消毒后剪开头皮，暴露颅顶前囱，参照《大鼠立体定位图谱》选取右侧脑部黑质坐标：A 点（硬膜下7.6 mm，中缝右2.4 mm，前囟后方5.0 mm）、B 点（硬膜下7.8 mm，中缝右侧1.6 mm，前卤后方5.6 mm），颅骨钻钻透颅骨，用10 μL的 Hamilton 注射器在 A、B 两点注射 2 μL 的 6-OHDA（5 g/L 溶于含0.2 g/L 抗坏血酸的无菌生理盐水中以防止氧化），以0.5 μL/min 的速度输送，结束后留针10 min 再缓慢退针；在两个坐标上总共注入了20 μg的6-OHDA（每个位点注入 10 μg）。另选21 只大鼠为假手术组（sham 组），采用相同方法麻醉、开颅、打孔，两点分别注射等体积的溶剂（含0.2 g/L 抗坏血酸的无菌生理盐水）。常规缝合、消毒，连续3 d腹腔注射青霉素预防感染。模型成功的鉴定标准［14］：造模 1 周后，腹腔注射 0.5 mg/mL 的 APO，10 min 后观察大鼠逆时针旋转圈数；除sham 组外，参与造模的大鼠共99只，造模过程中有5只大鼠死亡，94只大鼠进行APO 旋转诱导实验，均造模成功。然后从sham组和造模组大鼠中随机抽取3 只进行心脏灌注后取脑，免疫组化法检测大鼠脑黑质TH和α-Syn的表达，以进一步确定造模是否成功；若大鼠向一侧旋转圈数≥7 次/min，且脑黑质TH 阳性表达显著降低，α-Syn阳性表达显著增加，则为造模成功。

取90 只模型制备成功的大鼠随机分为模型（model）组、低剂量（36 mg/kg）NBP（NBP-L）组、高剂量（72 mg/kg）NBP（NBP-H）组 、NBP（72 mg/kg）+Agomir-NC（10 nmol）组 和 NBP（72 mg/kg）+Agomir-137（10 nmol）组，每组 18 只。NBP 各剂量组给予相应剂量的NBP 灌胃，每天1 次，连续给药21 d；NBP+Agomir-NC 组和 NBP+Agomir-137 组在给予 72 mg/kg NBP 灌胃前，通过侧脑室注射（前囟前0.3 mm，腹侧3.6 mm，左侧1.1 mm）分别将Agomir-NC 和Agomir-137 注射入大鼠的大脑；sham 组和model 组给予等体积生理盐水侧脑室注射和灌胃。

NBP 给药剂量换算：根据临床给药剂量（70 kg成人给药剂量400 mg/d），按种属间体表面积换算，对应大鼠给药剂量为成人的6.3 倍，换算大鼠等效剂量为 36 mg·kg-1·d-1，因此，设置 NBP 低、高剂量为36 和 72 mg·kg-1·d-1。

2.2 旋转实验 治疗结束后，腹腔注射APO进行旋转诱导实验，统计30 min 内每只大鼠旋转圈数，取平均值。

2.3 转棒实验 进一步评估大鼠的精细运动协调性和平衡能力。在测试前3 d 进行适应性训练。参数设置：初始速度，8 r/min；最大速度，在300 s 内达到30～40 r/min。在测试日，用同样的程序进行了3次实验。自动记录大鼠掉落转棒的时间，计算3 次实验的平均时间。

2.4 免疫组化法检测黑质中TH 和α-Syn 阳性表达 行为学检测完成后，每组随机选取6 只大鼠，左心室灌注后取脑，取右侧脑组织固定在4%多聚甲醛中。石蜡包埋后过脑黑质致密部（substantia nigra dense part，SNpc）作冠状切片（3 μm）。切片脱蜡水化，抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性酶后将其用5%BSA 封闭30 min，然后在室温下与Ⅰ抗（TH 和α-Syn，1∶500）孵育过夜。清洗后，与Ⅱ抗IgG（1∶500）进行第2 次孵育1 h，DAB 显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察黑质TH 和α-Syn 阳性表达情况（棕黄色）。每张切片选择3 个区域，使用Image-Pro Plus 6.0 软件分析并测定光密度，取平均值。

2.5 透射电子显微镜观察纹状体线粒体自噬情况 取左侧脑组织，分离纹状体，在2.5%戊二醛中固定48 h 后，放入1%锇酸固定液于4 ℃固定2 h，梯度乙醇脱水，包埋在环氧树脂中。在80 ℃下进行24 h 聚合，行超薄切片（约60～70 nm），乙酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察并拍照。

2.6 JC-1 法检测脑黑质-纹状体线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）变化 每组随机抽取6 只大鼠，取右侧中脑黑质纹状体，分离线粒体（按照线粒体分离试剂盒说明操作）。将分离的线粒体重悬后，取10 μL 加入96 孔板中，然后每孔中加入90 μL 的JC-1 工作液，混合；用多功能酶标仪测定红、绿荧光强度，计算红绿荧光强度比值。激发光为488 nm，发射光为530 nm 时（绿色荧光，检测JC-1 单体）的荧光值为A1；激发光为529 nm，发射光为590 nm 时（红色荧光，检测JC-1 聚合物）的荧光值为A2。各组的荧光值A=A2/A1，最终以相对荧光值（实验组A/对照组A）对MMP进行定量分析。

2.7 RT-qPCR 检测大脑miR-137 表达水平 剩余每组6 只大鼠，取脑后在冰上迅速分离出纹状体，分为两部分，一部分-80 ℃冰箱保存，用于Western blot实验；另一部分组织剪碎后，加入Trizol提取总RNA，紫外分光光度计检测总RNA 浓度和纯度，按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书将RNA 反转录成 cDNA，进行 qPCR 扩增。反应体系（20 μL）：SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA（200 mg/ L）1 μL，ddH2O 7.8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，进行40 次循环。以U6 为内参，相对miR-137的表达量采用2-ΔΔCt方法计算。

2.8 Western blot 检测线粒体自噬相关蛋白表达取-80 ℃冰箱保存的纹状体组织，在含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的RIPA 裂解液中匀浆，12 000×g离心15 min，取上清，BCA 法进行蛋白定量，平衡蛋白浓度、变性后每孔取30 μg蛋白样品上样，SDS-PAGE，湿转法转膜，5%脱脂奶封闭1 h，然后在4 ℃下与Ⅰ抗（PINK1、parkin、LC3A/B、p62 和 β-actin）孵育过夜。TBST 洗涤，加Ⅱ抗在室温下孵育2 h。洗去Ⅱ抗，ECL显色，分析膜上蛋白质表达水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3 统计学处理

实验所得数据以均数±标准差（mean±SD）表示。采用SPSS 22.0 和Image-Pro Plus 6.0 软件进行分析。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间有差异进一步采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PD大鼠模型的鉴定

APO 旋转诱导实验结果显示，与sham 组（6.85±0.57）相比，造模大鼠向一侧旋转圈数（234.28±26.19）显著增加（P＜0.01）。

免疫组化检测结果显示，与sham 组（1.00±0.00和1.00±0.00）相比，造模大鼠脑黑质TH 阳性表达（0.59±0.07）显著降低，α-Syn 阳性表达（1.86±0.21）显著升高（P＜0.01），见图 1。这说明PD 模型制备成功。

2 NBP对PD大鼠行为学的影响

与sham 组相比，model 组大鼠的旋转圈数显著增加，掉落潜伏期显著缩短（P＜0.05）；与model 组相比，NBP-L 组、NBP-H 组和 NBP+Agomir-NC 组大鼠的旋转圈数显著减少，掉落潜伏期显著增长（P＜0.05）；与NBP-H 组相比，NBP+Agomir-137 组的旋转圈数显著增加，掉落潜伏期显著缩短（P＜0.05），见表2。

3 NBP对PD大鼠黑质TH和α-Syn表达的影响

与sham 组相比，model 组大鼠黑质TH 阳性表达显著降低，α-Syn 阳性表达显著升高（P＜0.05）；与model 组相比，NBP-L 组、NBP-H 组和 NBP+Agomir-NC 组大鼠TH 阳性表达显著升高，α-Syn 阳性表达显著降低（P＜0.05）；与 NBP-H 组相比，NBP+Agomir-137组大鼠TH阳性表达显著降低，α-Syn阳性表达显著升高（P＜0.05），见图2、3及表3。

Figure 1. Immunohistochemical staining of TH and α-Syn in substantia nigra of rats in sham and model groups.The scale bar=200 μm.图1 假手术组和模型组大鼠黑质内TH 和α-Syn 的免疫组化染色

表2 各组大鼠旋转圈数和掉落潜伏期的比较Table 2. Comparison of the number of rotations and fall latency of rats in each group（Mean±SD. n=18）

4 NBP对PD大鼠线粒体自噬的影响

透射电镜下可见，sham 组大鼠纹状体细胞线粒体形态正常，线粒体嵴清晰可见并未见断裂，无明显自噬体；model组线粒体染色加深、肿胀破裂，内部嵴严重断裂或消失，有自噬体产生；NBP 各剂量组较model 组线粒体肿胀及内部嵴断裂消失现象明显减轻，线粒体形态趋于正常；而NBP+Agomir-137 组较NBP-H 组线粒体肿胀变形，内部嵴数量减少、破坏加重，见图4。

5 NBP对PD大鼠黑质-纹状体MMP的影响

与 sham 组相比，model 组大鼠 MMP 水平显著降低（P＜0.05）；与model组相比，NBP-L组、NBP-H组和NBP+Agomir-NC 组大鼠 MMP 水平显著升高（P＜0.05）；与 NBP-H 组相比，NBP+Agomir-137 组大鼠MMP水平显著降低（P＜0.05），见表4。

Figure 2. The results of immunohistochemical staining of TH in the substantia nigra of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. The scale bar=50 μm.图2 各组大鼠黑质TH免疫组化染色结果

Figure 3. The results of immunohistochemical staining of α-Syn in the substantia nigra of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. The scale bar=100 μm.图3 各组大鼠黑质α-Syn免疫组化染色结果

表3 各组大鼠黑质TH和α-Syn阳性表达的比较Table 3. Comparison of the positive expression of TH and α-Syn in the substantia nigra of rats in each group（Mean±SD. n=6）

6 NBP对PD大鼠纹状体miR-137表达的影响

Figure 4. Mitophagy status of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. Arrow：autophagosome；pentagram：chapped mitochondria with exudation. The scale bar=1 μm.图4 各组大鼠线粒体自噬情况

与 sham 组相比，model组大鼠 miR-137 表达水平显著升高（P＜0.05）；与 model 组相比，NBP-L 组、NBP-H 组和 NBP+Agomir-NC 组大鼠 miR-137 表达水平显著降低（P＜0.05）；与 NBP-H 组相比，NBP+Agomir-137 组大鼠miR-137 表达水平显著升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠MMP水平和miR-137表达的比较Table 4. Comparison of the level of MMP and the expression of miR-137 in each group（Mean±SD. n=6）

7 NBP对PD大鼠纹状体线粒体自噬相关蛋白表达的影响

与 sham 组相比，model组大鼠 PINK1 和parkin 表达及LC3-II/LC3-I 比值显著增加，p62 表达显著降低（P＜0.05）；与 model 组相比，NBP-L 组、NBP-H 组和NBP+Agomir-NC 组大鼠 PINK1 和 parkin 表达及 LC3-II/LC3-I比值显著增加，p62表达显著降低（P＜0.05）；与 NBP-H 组相比，NBP+Agomir-137 组大鼠 PINK1 和parkin 表达和 LC3-II/LC3-I 比值显著降低，p62 表达显著升高（P＜0.05），见图5。

Figure 5. The expression of mitochondrial autophagy-related proteins in the striatum of rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs NBP-H group.图5 各组大鼠纹状体线粒体自噬相关蛋白表达

讨 论

NBP 软胶囊是我国第1 个具有自主知识产权的心血管类Ⅰ类新药，用于治疗缺血性脑卒中，也是我国脑血管病领域第1 个进入美国FDA（美国食品药品监督管理局）临床试验的治疗急性缺血性脑卒中的药物，具有一系列的药理机制，包括保护线粒体功能、抑制氧化应激和神经元凋亡等［16］。NBP 可通过抑制小胶质细胞介导的神经炎症而发挥多巴胺能神经保护作用，对PD 具有良好的治疗作用［17］，从机理上讲，NBP 主要通过激活自噬保护线粒体，降解α-Syn来保护神经元［18］。

6-OHDA 是一种广泛用于PD动物模型的神经毒素，可损伤大脑中黑质-纹状体多巴胺能神经元，诱导氧化应激和线粒体功能障碍［19］，是经典的构建PD模型的方法之一，具有与PD 患者症状相似，多巴胺稳定丢失，长时间内无自发恢复的优点［20］。因此，本研究采用6-OHDA 诱导构建PD 模型，结果显示，6-OHDA 诱导大鼠出现明显的运动障碍、精细运动协调性和平衡能力下降的现象，且TH 阳性表达减少，α-Syn 表达增加，与以往的研究结果一致，说明模型复制成功。NBP 各剂量组大鼠的旋转圈数较PD 大鼠显著减少，在转棒上的停留时间显著高于PD 大鼠，提示NBP可以缓解PD大鼠的运动障碍。

自噬是线粒体清除受损的蛋白质或细胞器的主要途径，对于维持线粒体的自稳态以及细胞的存活至关重要。有报道显示，在不同的神经毒性PD 模型中均观察到线粒体受损和自噬失调［21］。MMP为检测细胞线粒体功能的早期指标之一；PINK1和parkin是线粒体的标志，对于维持线粒体的功能至关重要，与PD的发生、发展有关［22］。当线粒体受损时，PINK1在线粒体外膜上积累并招募parkin。随后，parkin 泛素化线粒体，将泛素结合型自噬受体（如p62）募集到线粒体。最后，受损的线粒体被LC3 阳性自噬体吞噬，启动自噬-溶酶体系统［23］。增强PINK1/parkin介导的线粒体自噬，可减轻PD 相关的线粒体功能障碍，发挥神经保护作用［24］。本研究采用透射电子显微镜观察纹状体线粒体自噬情况，结果显示PD 大鼠线粒体肿胀，内部嵴严重断裂或消失，并有自噬小体形成，且MMP 降低，说明线粒体出现损伤；而线粒体损伤是引起自噬发生的主要原因之一。经NBP 干预后，线粒体肿胀及内部嵴断裂明显减轻，自噬小体数量增多，MMP 升高；Western blot 结果也显示，NBP 可增加 PD 大 鼠 PINK1 和 parkin 表 达 及 LC3-II/LC3-I 比值，降低 p62 表达；与 Xu 等［24］的研究结果一致，提示NBP可促进线粒体自噬。

miR-137是大脑中丰富的微小核糖核酸，神经系统的发育、分化和成熟与miR-137 的表达及其对下游靶基因的调控密切相关［25-26］。研究显示，miR-137在PD 患者血液中存在高表达，miR-137 表达的降低能增强 PD 模型的神经保护特性［11，27］。Li 等［28］的研究显示miR-137 能够通过抑制线粒体自噬受体FUNDC1和NIX 的表达，减少与LC3结合的线粒体受体的数量，进而调节线粒体自噬；另有研究显示miR-137 可能抑制parkin 从胞质转位至线粒体，并抑制线粒体蛋白如Tom20、Tim23 和VDAC1 的降解及LC3-I型向LC3-II 型的转换，减弱线粒体自噬程度；而细胞内低水平的自噬正是 PD 的诱因之一［12］。NBP 可通过促进parkin 及干扰去泛素化酶USP30 的表达提高parkin 的泛素化活性促进线粒体自噬，改善AD 小鼠认知障碍［10］，且 parkin 是 NBP 通过调控线粒体自噬发挥抗AD 作用的关键效应因子［29］。本研究结果显示PD 大鼠脑组织miR-137 的表达水平显著升高，经NBP 干预后，其表达水平降低，与线粒体自噬变化趋势相反，提示NBP 对线粒体自噬的促进作用可能与miR-137 表达水平的降低有关。为了进一步验证此推测，我们采用侧脑室注射的方式将Agomir-137 注射到接受NBP 干预的PD 大鼠脑组织中，结果观察到，NBP 对PD 大鼠线粒体自噬的促进作用被显著减弱；说明，NBP可能通过降低miR-137的表达，增强线粒体自噬，进而发挥对PD大鼠的保护作用。

综上所述，NBP 对PD 大鼠的保护作用可能与降低miR-137 的表达，促进线粒体自噬有关。但本研究尚存在一定不足，对PD 大鼠的非运动症状如认知障碍未进行检测，后续将进行补充研究；此外，本研究仅在动物水平上进行了初步探究，下一步将采用体外细胞实验对此结论进行深入验证。