黄连素通过激活AMPK改善同型半胱氨酸诱导的大鼠痴呆和Tau蛋白过度磷酸化*

王 林， 丁 见， 吴 超， 张 翠， 李 曙， 胡泽波， 周新文

（1皖南医学院基础医学院，安徽芜湖241002；2华中科技大学病理生理学系，湖北武汉430030）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种不可逆、且进行性的神经退行性疾病，约占所有老年痴呆症病例的 60%～80%［1］。AD 两大主要特征性病理改变为β 淀粉样多肽（amyloid beta peptide，Aβ）沉积形成的老年斑和神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs），NFTs 主要由过度磷酸化的 Tau 蛋白形成［2］。Tau 蛋白可以在多个丝氨酸（serine，Ser）或苏氨酸（threonine，Thr）位点被磷酸化，例如 Ser396（pS396）和 Thr205（pT205）等。高同型半胱氨酸血症、高血糖、神经炎症、氧化应激和高胆固醇血症等都与AD 发生发展密切相关［3］，我们前期建立的尾静脉注射同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）大鼠AD样模型显示，模型大鼠的认知功能受损，海马区Tau蛋白过度磷酸化［4］。AD 的病因和发病机制复杂，药物开发至今为止多以失败告终。

中药黄连素（berberine，BBR）是一种广泛应用的异喹啉生物碱，具有抗病毒、抗菌和抗炎等多种生物活性［5］。研究表明黄连素对多种中枢神经系统疾病，如帕金森病、亨廷顿病和AD 等具有神经保护作用［6-8］。在糖尿病大鼠中，黄连素可抑制炎症、氧化应激和改善脑中胰岛素抵抗进而改善大鼠的认知功能［9］；在 APP/Tau/PS1 AD 转基因鼠中给予黄连素治疗后，可降低Aβ1-42的水平和改善认知障碍［10］。以上研究结果表明黄连素在AD 发病机制的多个环节起作用，但是黄连素如何调控Tau 蛋白磷酸化水平的具体机制尚不明确。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个催化亚基α、两个调节亚基β 和γ 组成的异源三聚体复合物，上游可通过磷酸化AMPK α 亚基上Thr172 位点（p-AMPK）激活AMPK［11］。AMPK 可调节细胞内的一些代谢途径，如葡萄糖的摄取和运输，脂肪酸和蛋白质的合成，以及脂肪酸的β-氧化等。本课题组前期研究已证实，随着年龄增加，小鼠海马中AMPK 的活性逐渐降低，而激活AMPK 可降低Tau 蛋白的磷酸化水平［12］。在细胞水平上黄连素可激活AMPK［13］，在 AD 动物模型中，黄连素能否通过激活AMPK 改善认知功能障碍和降低Tau 蛋白磷酸化水平值得研究。因此，本研究利用尾静脉注射Hcy 建立AD 样大鼠模型，探究黄连素的神经保护作用及机制。

材料和方法

1 实验动物及处理方法

36 只 SPF 级 3 月龄 SD 大鼠，雄性，体重 200～250 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号为SCXK（湘）2019-0014。实验前适应性饲养1 周，自由饮食、饮水，温度（23±1）℃，湿度（50±10）%，光照和黑暗交替各12 h。36 只大鼠随机分为3 组：对照组（NS 组）、模型组（Hcy+NS 组）及治疗组（Hcy+BBR组），每组12 只。模型组和治疗组大鼠尾静脉注射Hcy（400 μg·kg-1·d-1）14 d，对照组大鼠尾静脉注射相同剂量的生理盐水（normal saline，NS）14 d。随后治疗组大鼠用黄连素灌胃（100 mg·kg-1·d-1）10 周，对照组和模型组大鼠用相同体积的NS 灌胃10 周。具体流程图见图1A。所有动物实验均经过皖南医学院实验动物福利与伦理委员会批准。

2 细胞培养

HEK293-Tau 细胞（稳定转染人类全长Tau 蛋白的人胚肾母细胞瘤细胞）由华中科技大学同济医学院病理生理学系周新文老师课题组惠赠，细胞于5%CO2、37 ℃恒温恒湿的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清和G418 的DMEM 高糖培养液培养。先检测不同浓度（2.5、5、10 和 20 μmol/L）BBR 对细胞活力和AMPK 活性的影响，最终确定用于后续实验的浓度为 5 μmol/L。细胞实验分组为 3 组：对照（control，CON）组：单独 DMSO 处理 24 h；BBR 组：5 μmol/L BBR 和 DMSO 共同处理 24 h；BBR+Compound C 组：5 μmol/L BBR 和 20 μmol/L Compound C 共 同 处 理24 h。

3 主要药品试剂和仪器

Hcy 和 Compound C 购自 Sigma；BBR 购自上海源叶生物科技有限公司；兔抗AMPK、p-AMPK、PSD93、PSD95、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）和GSK-3β Ser9 位点磷酸化（GSK3β-S9）多克隆抗体购自Cell Signaling Technology；兔抗pT205 和pS396 多克隆抗体购自Biosource；鼠抗蛋白磷酸酶2A 催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit，PP2Ac）和 PP2Ac 亮氨酸 309 位点去甲基化（DM-PP2Ac）单克隆抗体购自 Sigma；鼠抗 PP2Ac 的酪氨酸307 位点磷酸化（p-PP2Ac）单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；鼠抗 β-actin 和 Tau5 单克隆抗体购自Abcam；CCK-8 试剂盒、羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术有限公司；高尔基染色试剂盒购自FD Neuro Technologies；胎牛血清、DMEM高糖培养基、G418 和胰酶购自Gibco。培养瓶和培养板等细胞培养耗材购自NEST；SDS-PAGE 电泳仪及成像分析仪购自Bio-Rad；倒置显微镜购自Olympus；水迷宫实验设备购自泰盟公司。

4 主要实验方法

4.1 Morris 水迷宫实验 用Morris 水迷宫实验评价大鼠的空间学习记忆能力。前5 d 训练大鼠在水迷宫设备中寻找一个隐藏的平台（低于水面1 cm），每天训练4 次，在每次实验中，当大鼠爬上平台并保持15 s 时，实验结束；如果大鼠在90 s 内没有找到隐藏的平台，它们会被引导到平台上，并停留15 s。记录大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期）。在检测记忆能力之前，让大鼠休息1 d，第7天移走平台进行空间探索实验，大鼠自由游泳90 s，记录大鼠游过原平台的次数、大鼠在原平台所在象限的时间及大鼠游泳的速度。采用装置自带跟踪软件记录大鼠的运动轨迹。实验期间保持固定的实验人员和安静的实验环境。

4.2 Western blot 于Morris 水迷宫实验后收集大鼠脑组织，BBR处理24 h后收集细胞样品，BCA 法检测各样品蛋白浓度，随后加入上样缓冲液，沸水中煮10 min使蛋白充分变性。变性后的蛋白（20 μg）进行SDS-PAGE 分离蛋白，将凝胶中的蛋白转移至NC 膜上，并用脱脂奶粉溶液进行封闭，封闭完成后用Ⅰ抗孵育，4 ℃过夜，再加入Ⅱ抗室温孵育2 h，最后在凝胶成像仪上曝光显影。显影后以β-actin 为内参照，用ImageJ软件量化目的蛋白的表达水平。

4.3 免疫组化实验 4%多聚甲醛灌流后快速取脑组织，继续浸泡4%多聚甲醛溶液48 h，随后用30%蔗糖溶液脱水，冰冻切片（片厚30 μm），将脑片放入4℃冰箱保存。挑取脑片PBS 漂洗后加入3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶活性，加入枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，5% BSA 室温封闭60 min，加入Ⅰ抗pS396（稀释比为1：100），4℃孵育过夜。回收Ⅰ抗，PBS 漂洗后加入生物素标记的组化Ⅱ抗（羊抗兔IgG），37℃孵育1 h。最后加入DAB 显色液，避光显色3 min 左右用PBS 冲洗终止显色。贴片，室温干燥后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，显微镜下观察和拍照。

4.4 高尔基染色 生理盐水灌流后立即取脑组织，浸泡于试剂盒中A、B 混合液中，24 h 后更换新鲜A、B混合液，室温，避光放置21 d，隔2 d更换AB混合液一次。21 d 后脑组织放入C 液中，24 h 后更换新鲜C液，继续避光放置2 d。震荡切片机（50 μm）切片，脑片室温避光晾干。脑片用双蒸水冲洗后放入D、E 混合液中染色10 min，染色过程中始终保持脑片湿润。梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。低倍镜下先确定海马CA3 区神经元，在油镜下选择距胞体90～110 μm（近端）和190～210 μm（远端）的2 个树突段进行拍照，用ImageJ 计算每个神经元10 μm 树突长度上的树突棘数量，即树突棘密度。

4.5 CCK-8 法检测BBR 对细胞活力的影响 将制备好的细胞悬液接种到96 孔板中，每孔约100 μL，将96孔板放入培养箱中培养24 h。各孔中加入不同浓度的黄连素，同时设置空白对照组和正常对照组，每组样本做6 个复孔，继续孵育24 h 后更换含10%CCK-8 的新鲜培养基，加样的过程中尽量不要产生气泡。最后再放入培养箱中孵育30 min，用酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A）值并计算细胞活力。

5 统计学处理

使用SPSS17.0 统计软件处理数据，数据用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD 法），以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 黄连素对Hcy大鼠空间学习记忆能力的影响

Morris 水迷宫结果显示，在训练第5 天，与NS 组相比，Hcy+NS 组大鼠的逃避潜伏期显著延长（P＜0.05）；与 Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组大鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05），见图 1B；与 NS 组相比，Hcy+NS 组大鼠穿越原平台次数显著减少（P＜0.05），在原平台所在象限停留时间也显著缩短（P＜0.05）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组大鼠穿越原平台次数显著增加（P＜0.05），并且在原平台所在象限停留时间也显著延长（P＜0.05），见图1D、E；同时记录大鼠的游泳速度，结果显示3 组大鼠游泳速度并无显著差异（P＞0.05），见图1C；各组大鼠运动轨迹见图1F。

Figure 1. The therapeutic effects of BBR on the cognitive decline of Hcy rats. A：diagram of the experimental procedure；B：the escape latency to find the hidden platform；C：the swim speed on day 7；D：the number of crossing the platform region；E：the time spent in the target quadrant；F：the representative swimming paths on day 5. Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs NS group；#P＜0.05 vs Hcy+NS group.图1 黄连素对Hcy大鼠认知功能的影响

2 黄连素对Hcy 大鼠海马区突触蛋白和树突棘密度的影响

Western blot 实验结果显示，与 NS 组相比，Hcy+NS 组大鼠海马区突触蛋白（PSD93 和PSD95）的表达水平显著降低（P＜0.01）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组大鼠海马中PSD93 和PSD95 的表达水平显著升高（P＜0.05），见图2A。高尔基染色结果显示，与NS 组相比，Hcy+NS 组大鼠海马CA3 区树突棘密度显著降低（P＜0.01）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组大鼠海马CA3 区树突棘密度显著升高（P＜0.05），见图2B。

Figure 2. The expression of synaptic protein and spine density in the hippocampal of the rats in each group. A：comparison of PSD93 and PSD95 protein levels in the hippocampal of rats in each group（n=6）；B：representative shaft dendrites in hippocampal neurons of the CA3 region in each group by Golgi staining and quantitative analysis（n=3）. Mean±SD.**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05 vs Hcy+NS group.图2 各组大鼠海马区突触蛋白的表达和树突棘密度

3 黄连素对Hcy 大鼠海马区Tau 蛋白磷酸化水平的影响

Western blot 实验结果显示，与NS 组相比，在Hcy+NS 组大鼠的海马区pT205 表达水平显著升高（P＜0.01）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组大鼠海马中 pT205 表达水平显著降低（P＜0.01），见图 3A。Western blot 和免疫组化实验结果均显示，与NS组相比，Hcy+NS 组大鼠海马区pS396 表达水平显著升高（P＜0.05）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组的大鼠海马区pS396 表达水平显著降低（P＜0.05），见图3B。但是总Tau 蛋白（Tau5）的表达水平在各组大鼠海马中无显著差异（P＞0.05），见图3。

4 黄连素对Hcy 大鼠海马区Tau 蛋白激酶和磷酸酶的影响

Western blot 实验结果显示，与 NS 组相比，Hcy+NS 组大鼠海马区p-AMPK 表达水平显著降低（P＜0.01）；与 Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组的大鼠海马区p-AMPK表达水平显著升高（P＜0.01）；但是AMPK的表达水平在各组大鼠海马中并无显著差异（P＞0.05）。GSK3β-S9和GSK3β 的表达水平在各组大鼠海马中并无显著差异（P＞0.05）。与NS组相比，Hcy+NS 组大鼠海马区p-PP2Ac 和DM-PP2Ac 表达水平显著升高（P＜0.05）；与Hcy+NS 组相比，Hcy+BBR 组的大鼠海马中p-PP2Ac 和DM-PP2Ac 的表达水平显著降低（P＜0.05）；但是在各组大鼠海马中，PP2Ac 的表达水平无显著差异（P＞0.05），见图4。

Figure 3. The expression level of phosphorylated Tau protein in the hippocampal of the rats in each group. A：the levels of total Tau（Tau5）and phosphorylated Tau（pT205，pS396）in the hippocampal of rats in each group were measured by Western blot；B：representative images of brain slice immunostained with pS396 and quantitative analysis of pS396 staining. Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy+NS group.图3 各组大鼠海马区Tau蛋白磷酸化水平

5 不同浓度的黄连素对HEK293-Tau 细胞活力和AMPK活性的影响

在HEK293-Tau细胞中，给予不同浓度BBR作用24 h，CCK-8法检测结果显示，与对照组相比，BBR 分别在 10 μmol/L 和 20 μmol/L 时对细胞的活力抑制有统计学差异（P＜0.05），见图5A。Western blot 实验结果显示，BBR（2.5 μmol/L）组p-AMPK 表达水平与对照组相比无显著性差异，而BBR（5 μmol/L）组中p-AMPK 表达水平较对照组显著升高（P＜0.01），见图5B。AMPK 的表达水平在各组中并无显著差异（P＞0.05），见图5B。

6 黄连素通过AMPK/PP2Ac降低HEK293-Tau细胞中Tau蛋白磷酸化水平

实验结果显示，与 CON 组相比，BBR 组 pT205 和pS396 表达水平显著降低（P＜0.01），与BBR 组相比，BBR+Compound C 组pT205和pS396表达水平显著升高（P＜0.05），Tau5 的表达水平在各组间无显著差异（P＞0.05）。与CON 组相比，BBR 组中 p-AMPK 表达水平显著升高（P＜0.05），与BBR 组相比，BBR+Compound C 组中p-AMPK 表达水平显著降低（P＜0.05），AMPK 的表达水平在各组间无显著差异（P＞0.05）。与 CON 组相比，BBR 组 p-PP2Ac 和 DM-PP2Ac 表达水平显著降低（P＜0.05），与BBR 组相比，BBR+Compound C 组 p-PP2Ac 和 DM-PP2Ac 表达水平显著升高（P＜0.05），PP2Ac 的表达水平在各组间无显著差异（P＞0.05），见图6。

Figure 4. Comparison the activity of AMPK，GSK3β and PP2Ac in the hippocampal of the rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy+NS group.图4 比较各组大鼠海马区AMPK、GSK3β和PP2Ac的活性

讨 论

研究报道，增加大鼠血浆中Hcy 浓度，可以诱导AD 样认知功能障碍、Aβ 沉积和Tau 蛋白过度磷酸化［14-16］。本研究与以往研究结果相似，水迷宫实验结果显示Hcy 大鼠的学习记忆能力受损。Hcy 通过多种途径分解代谢，其中之一是叶酸/维生素B12 依赖的再甲基化。虽然维生素B12 和叶酸的补充可有效的降低血浆中Hcy 浓度，但与安慰剂相比，叶酸和维生素B12 的补充并没有改善健康或认知障碍患者的认知功能［17］。这一结果表明Hcy 可能通过血管或神经毒性等多种途径引起脑功能障碍。

黄连素可改善AD 转基因鼠（3×Tg AD 小鼠）和2型糖尿病大鼠的认知功能障碍［18-19］，但黄连素能否改善Hcy 诱导的大鼠认知功能障碍目前并没有被详细探讨。本研究水迷宫实验结果显示黄连素（100 mg·kg-1·d-1）灌胃 10 周后，可显著改善 Hcy 大鼠的空间学习记忆能力。突触是学习和记忆的基本单位，在轻度认知损伤患者和AD 患者的早期阶段已观察到突触功能受损［20］；在AD 转基因鼠（APP/PS1 小鼠）海马中，突触蛋白PSD93 和PSD95 的含量显著降低，提高突触蛋白的表达水平可改善认知功能［21］。Hcy 可引起 PSD93 和 PSD95 的表达水平降低［15］。为解释黄连素显著改善Hcy 大鼠的空间学习记忆能力的机制，我们检测了树突棘密度和突触蛋白的表达水平，结果显示黄连素治疗后Hcy 大鼠海马区PSD93 和PSD95 表达水平显著升高，树突棘密度显著增加。表明黄连素改善Hcy 大鼠的认知功能可能与增加突触蛋白和树突棘密度有关。

Figure 5. Effect of BBR on viability and AMPK activity in HEK293-Tau cells. A：the viability of HEK293-Tau cells after BBR treatment was tested by CCK-8；B：the levels of AMPK and p-AMPK in HEK293-Tau cells after BBR treatment were measured by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.图5 BBR对HEK293-Tau细胞活力和AMPK活性的影响

黄连素通过激活糖尿病模型动物的AMPK 活性，从而提高胰岛素的敏感性和降低全身肥胖［22］。神经母细胞瘤细胞和皮层神经元的实验结果显示，黄连素通过激活AMPK 减少Aβ 的生成并降低APP裂解酶（BACE1）的表达［13］。本研究的动物实验结果显示Hcy 模型大鼠的AMPK 活性降低、Tau 蛋白磷酸化水平增加，而黄连素治疗后，AMPK 的活性升高而且伴随着Tau 蛋白磷酸化水平降低。我们前期研究结果显示，激活AMPK 可以显著降低糖尿病小鼠海马区Tau 蛋白磷酸化水平［12］。为了阐明黄连素是否通过激活AMPK降低Tau蛋白磷酸化水平，我们用黄连素处理HEK293-Tau 细胞，同时给予（或不给）AMPK 抑制剂（Compound C），结果显示AMPK 抑制剂特异性的阻断黄连素对抗Tau 蛋白磷酸化的作用。该实验证实黄连素通过激活AMPK 而降低Tau蛋白的磷酸化水平。

GSK3β 是Tau 蛋白过度磷酸化的最重要的激酶，其活性位点Ser9 位点的磷酸化水平降低时，GSK3β 活性增加，引起 Tau 蛋白磷酸化水平增加［23］。PP2A 是降低 Tau 蛋白磷酸化水平的重要磷酸酶［24］，其活性主要受催化亚基（PP2Ac）的酪氨酸307 位点（Tyr307）磷酸化水平和亮氨酸309 位点（Leu309）甲基化水平调节，磷酸化水平增加和/或甲基化水平降低使PP2Ac 酶活性降低［25］。课题组前期研究结果显示，AMPK 可抑制 GSK3β 的活性，同时降低 Tau 蛋白的磷酸化水平［12］。因此，我们检测 GSK3β 和 PP2Ac表达和其活性依赖的磷酸化水平。本研究结果显示，各组大鼠海马中GSK3β 活性没有变化，说明GSK3β 没有参与黄连素对抗Tau 蛋白磷酸化水平的过程中。动物实验结果显示Hcy 模型大鼠PP2Ac 活性显著降低，黄连素治疗后PP2Ac 活性显著升高，提示PP2Ac 参与黄连素对抗Hcy 诱导的Tau 蛋白过度磷酸化。细胞实验结果显示，黄连素和Compound C共同处理细胞时，AMPK 和PP2Ac 的活性降低，Tau蛋白磷酸化水平也增加，进一步证实黄连素通过激活AMPK 进而增加PP2Ac活性，从而阻止Tau蛋白过度磷酸化。

综上所述，黄连素通过调节AMPK/PP2Ac 通路，显著改善Hcy 大鼠的学习记忆能力和降低Tau 蛋白磷酸化水平，从而发挥神经保护作用。

Figure 6. BBR could reduce phosphorylation of Tau via AMPK/PP2Ac pathway in HEK293-Tau cells. Levels of pT205，pS396 ，p-AMPK，p-PP2Ac and DM-PP2Ac in HEK293-Tau cells after BBR with or without Compound C treating were measured by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BBR group.图6 在HEK293-Tau细胞中，BBR通过AMPK/PP2Ac降低Tau蛋白的磷酸化水平