泉州仿生栽培铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及抑菌研究＊

徐焰平 王翠玲＊

（泉州医学高等专科学校检验预防学院，福建 泉州 362010）

铁皮石斛是一种药用植物，化学成分经药理学研究具有提高免疫功能、抗肿瘤等作用[1]。内生真菌生物类群丰富，经研究发现于各种植物体内普遍存在，药用植物内生真菌能产生与宿主相同或类似药用活性成分[2]。前期有多个研究者从药用植物铁皮石斛中分离内生真菌，从中筛选出能够产生抗菌、提高机体免疫力或抗肿瘤成分的内生真菌[3]。从中寻找新活性先导化合物，拓宽和丰富新药源发现的渠道，可通过规模化的发酵获取较多量的产物，用于新药研发[4]。本项目从泉州仿生栽培的铁皮石斛中分离出内生真菌，进行抑菌活性研究，并对具有抑菌活性的内生真菌进行鉴定。

一、材料与仪器

1.材料

龙眼树上仿生态栽培的铁皮石斛来自泉美生物科技有限公司，标准菌株金色葡萄球菌ATCC 25923、大肠杆菌ATCC 25922和蜡样芽孢杆菌ATCC 14579由本实验室提供。

2.药品和试剂

马铃薯葡萄糖琼脂、LB培养基购自广东环凯生物科技有限公司、PBS缓冲液（pH值7.4）在本实验室配置。ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS5 5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3’由大连Takara公司合成。

3.仪器设备

生物安全柜、显微镜、培养箱、analytikjena EasyCycler PCR仪、analytikjena UVsolo toutch等。

二、实验方法

1.内生真菌的分离

铁皮石斛样本采集到实验室后应该于24h内进行内生真菌的分离。从采集的样品中选取新鲜健康的铁皮石斛，先用自来水冲洗干净，去除表面杂土颗粒后自然晾干备用。根部和茎部剪成1cm左右的小段，叶片剪成0.5×0.5cm大小置于小烧杯中。在生物安全柜中，用75%酒精浸泡60s，接着用无菌水浸洗3次，再用3%次氯酸钠（有效氯）溶液浸泡4min，最后再用无菌水浸洗3次。滤干余液后用镊子将样本置于含链霉素（50～100mg/L）和青霉素（100～300mg/L）马铃薯葡萄糖琼脂平板中，每直径为9cm的培养皿放入6～8个组织块。放入培养箱28℃培养5～10d，待样本周围长成肉眼可见的菌落时，用接种钩挑取菌落边缘的菌丝体移入另一个平板上，继续培养。将分离到的优势菌种利用平板划线法进一步行进纯化分离，连续富集培养3次。当富集培养不再出现杂菌时，再一次用平板划线法进行最后一轮菌株分离纯化，重复3次。肉眼观察真菌的特征，选择生长优良的菌株。将得到的优势菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，28℃培养3～5d，放在4℃冰箱保存备用[5]。

2.抑菌活性筛选

将上述分离到的内生真菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板中，放置于培养箱28℃培养5d。用无菌打孔器打出直径6mm的菌饼，放置于装有50mL液体马铃薯葡萄糖培养基的250mL锥形瓶中，放置于恒温振荡培养箱中培养5d后制成内生真菌发酵液。培养条件为：温度28℃，转速200rpm。利用杯碟法（琼脂扩散法）测定内生真菌对金色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽包杆菌三种细菌的抑菌功能，分别吸取0.1mL三种待测细菌的菌液到LB平板表面，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min。用灭菌镊子将无菌牛津杯置于平板中预定位置，再用镊子尖端轻轻按压牛津杯上部使之与培养基表面紧贴。往牛津杯中加入100µL内生真菌发酵液，置于恒温培养箱中37℃培养18～24h，测量抑菌圈直径，并计算其平均值，每个实验重复三组[6]。

3.内生真菌的鉴定

3.1 菌株形态学观察。挑取已分离纯化具有抑菌活性的QZQM08的新生菌丝，接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，倒置于恒温培养箱中28℃培养，观察该菌的菌落形态，并记录其菌落大小、正反面的颜色、边缘菌丝形态及是否产生孢子和孢子的颜色等特征。并利用铜圈进行小培养，观察真菌的结构及生长发育过程。根据菌落培养特征和显微镜下菌丝和孢子的形态特对分离菌株进行初步鉴定[7]。

3.2 菌株的分子鉴定。按2.2的方法进行真菌菌种培养，用改进的蛋白酶K和苯酚抽提法进行基因组DNA的分离与纯化。利用通用引物ITS4和ITS5进行ITS区域的扩增，扩增条件为：反应体系25uL，ddH2O 16.75µL；10×PCR Buffer 2.5µL；dNTP 2.5µL；ITS4和ITS5各1µL， 模板DNA luL（20～50ng）；TaKaRa rTaq酶0.25µL。 在analytikjena EasyCycler PCR仪按以下程序进行PCR扩增：95℃预变性5min使模板变成单链，95℃变性30S，将反应体系温度下降至55℃退火30S，再升温至72℃延伸1min，循环次数30次；最后在72℃延伸5min。用生工生物工程（上海）股份有限公司的3S柱式离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒，按说明书的要求进行的扩增产物的纯化[8]。将上一步提取的DNA送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。完成测序后将所得核酸序列提交至NCBI进行Blast比对，下载软件MEGA version 5.0进行NJ系统发育树构建[9]。

三、结果与讨论

1.仿生栽培铁皮石斛内生真菌的分离

经表面消毒的铁皮石斛组织块在培养3～4d后，逐渐观察到有菌丝从组织块的切口处长出。经过分离，从泉州地区仿生栽培铁皮石斛中分离到内生真菌21株，从叶片中分离到10株（47.62%），从茎中分离到6株（28.57%），从根中分离到5株（23.81%）。

2.内生真菌的抑菌活性

通过抑菌活性实验，发现分离到的内生真菌有17个菌株的发酵液至少对一种以上的供试细菌有抑菌活性，其中内生真菌QZQM08对三种供试细菌的抑菌活性最强（如表1所示）。

表1 内生真菌发酵液的抑菌活性

3.内生真菌QZQM08的菌落形态特征和鉴定结果

将抑菌活性最强的内生真菌QZQM08进行大培养和小培养。在平板上该菌菌落颜色为绿色，属于快速生长真菌，呈放射状生长形成密集的毡状，表面质地疏松、干燥、不透明。通过小培养直接观察该菌菌丝透明有隔，有丰富的分枝，分生孢子梗呈树枝型。分生孢子呈圆形至椭圆形，单生或串生，初步判定为木霉属真菌。对PCR产物进行测序，并将所得核酸序列提交至NCBI进行Blast比对，选取GenBank中与QZQM08的ITS序列同源性高的系列菌株用于系统发育分析。结果表明，与QZQM08相似性较高的序列主要分布在木霉属。