肺移植免疫学相关基础与临床研究进展

肖漓 解立新 石炳毅

肺移植可实现肺生理功能重建，已成为救治终末期肺病患者的有效手段。近年来肺移植数量逐年增加，伴随术后管理经验和外科手术的日臻完善，以及强有力免疫抑制剂的应用，肺移植受者短期生存率明显提高。国际心肺移植学会（International Society for Heart and Lung Transplantation，ISHLT）2019年报道，肺移植受者术后1年生存率约为80%，中位生存期为6.7年[1]。与其他实体器官移植相比，肺移植受者长期预后较差，术后各种并发症包括原发性移植物功能障碍、急性排斥反应（acute rejection，AR）、慢性移植物失功和感染等，是肺移植受者术后短期和长期生存的主要障碍。首先，肺移植存在与其他器官移植共性的问题，包括排斥反应和感染，术后受者的免疫系统识别移植肺抗原，移植肺中的免疫过客细胞也可识别受者组织抗原，产生同种异体排斥反应[2]；免疫抑制剂的应用使受者机体处于免疫抑制状态，极大增加了发生感染和肿瘤的风险。其次，正常情况下，肺脏将接触外界环境的微生物吸入到肺泡，构建了个体独特的微生物群，参与维持呼吸生理和免疫的内环境稳定。肺移植供、受者呼吸道内微生物群之间的差异可能导致固有免疫和获得性免疫应答[3]。因此，肺移植涉及的免疫机制更为复杂，需深入认识同种异体免疫应答过程中的免疫学共性机制，特别关注肺脏特异性免疫学特点，探索如何提高肺移植受者的长期生存率，为移植物失功的防治等提供理论依据。本文针对肺移植中涉及免疫相关的临床诊断和基础研究进行总结讨论。

1 肺脏免疫细胞组成的独特性

肺移植受者的生存率与免疫抑制方案有关，目前临床普遍采用的方案较少考虑肺脏独特的免疫学特性。作为机体抵抗感染的第一道防线，部分外来抗原可进入下呼吸道的内皮层，肺脏具有明显区域特性的免疫细胞，但有关研究非常有限[4]。因此，结合免疫细胞特性，探讨肺移植术后免疫功能的相关问题十分必要。

为了维持正常的呼吸功能，肺部的免疫系统需要严格精细的调控，既要清除外来病原体，又要避免炎症反应的扩大造成自身组织损伤，肺脏具有明显的免疫耐受和免疫调节特征[5]。肺部的免疫系统与传统的主体免疫系统存在较大差异，具有特殊的细胞亚群和关键分子：（1）在其他器官组织中少有，而在肺脏大量存在的T细胞亚群，包括调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）、辅助性T细胞（helper T cell，Th）17、自然杀伤（natural killer，NK）T 细胞和CD4−CD8−T细胞（高达淋巴细胞的20%），其参与肺部免疫调节和免疫防御的机制仍亟待揭示[6]；（2）肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）在病原体入侵时活化，负责吞噬和清除外来抗原，转化生长因子（transforming growth factor，TGF）可抑制其功能，有效防止炎症反应扩大，避免机体引发过度免疫防御；（3）中性粒细胞可参与肺组织的防御、损伤和修复，是肺脏的第二道防线，其迁移的严格调控是既能保证正常行使监督功能，又能抑制肺泡发生炎症反应的重要因素，逐渐成为肺移植领域的研究热点，肺移植术后中性粒细胞进入肺间质和气道，参与早期的固有免疫应答及随后的获得性免疫应答[7]；（4）分布在气道上皮的肺神经内分泌细胞是唯一受神经系统支配的内分泌细胞，作为化学感受器接受低氧、高碳酸血症等各种刺激，参与调控肺的发育。此外，肺组织中上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维细胞等非传统免疫细胞，以及肺表面活性蛋白A、肺表面活性蛋白D等均具有免疫属性，均可参与呼吸系统的炎症调节[8]。

肺脏免疫细胞组成的独特性决定了其免疫功能的特异性[9]。不仅要研究肺移植与其他实体器官移植共性机制，还应重视其特性特征，以更深入地理解肺移植免疫学原理，为肺移植术后并发症的诊断和临床管理提供更全面的理论依据。

2 肺移植排斥反应的特点和诊断

AR是发生慢性移植肺功能障碍的主要危险因素之一。肺部排斥反应的发生比其他器官更快速，肺移植术后1年AR的发生率达60%，且即使仅发生一次轻微的AR，也是导致慢性移植肺功能障碍的独立危险因素[10]。

肺移植术后早期免疫应答与预后相关性较大，小鼠肺移植模型证实术后72 h内的排斥反应可逆，移植物长期存活与新生支气管淋巴组织有关，呈现Foxp3+细胞聚集，受体T细胞与CD11c+树突状细胞相互作用[11]。目前普遍认为直接或间接的同种异体反应性T细胞只能在次级淋巴器官被激活。有研究发现通过阻断淋巴循环传入组织，可防止豚鼠皮肤移植的排斥反应[3]。另有报道建立小鼠肺移植模型，并利用双光子显微镜观察，发现术后30 h内，移植肺组织中受体T细胞聚集在供体来源的CD11c+树突状细胞周围，证实移植肺可快速激活同种异体免疫应答，而不依赖于次级淋巴器官，这可能是肺移植排斥反应发生时间早于其他器官移植的原因[7]。

T细胞是排斥反应过程最为重要的核心免疫细胞之一，动物模型研究发现CD4+T细胞亚群对移植器官具有保护性和损伤性的双重效应[12]。Th1、Th17、Th22和滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell，Tfh）表现出促炎作用，而Treg、Th2和Th9却发挥抗炎作用。Th1和Th17具有很强的促炎特性，白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-17和干扰素（interferon，IFN）同时阳性可促进急性和慢性肺移植排斥反应。Treg具有抗炎作用，对同种异体移植物具有保护作用。Th2可通过产生IL-6发挥促炎作用，Th9分别通过产生IL-9和IL-10发挥促炎和抗炎作用[12]。

肺移植术后受者T细胞亚群的研究有待细化。练巧燕等[13]回顾性分析了41例肺移植术后稳定状态受者1年内外周血T细胞亚群的动态变化，发现CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞绝对值在术后2周下降，6个月内逐渐恢复。 Coiffard等[14]则报道了术后1年内受者淋巴细胞亚群与年龄具有相关性。

外周血和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的细胞计数对AR的诊断具有一定价值，但由于其灵敏度和特异度较低，目前无法独立地用于临床诊断。为改善用于AR诊断的性能，国外报道了肺移植AR时血浆和BALF中的细胞因子作为诊断标志物的潜在作用，结果显示BALF中IL-1、IL-6、IL-15、IL-17和CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）10水平升高，而IL-8和IL-18水平下降[15]。总之，单个细胞因子不足以诊断AR，多种细胞因子联合形成的综合评分，可提高诊断的准确性，对临床应用具有一定的指导意义。

闭塞性细支气管炎综合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）可影响移植肺的长期存活，且促炎因子缺乏和颗粒酶B增加可导致肺移植术后BOS。研究发现，BOS患者CD4/CD28nullT细胞和CD8/CD28nullT细胞产生的颗粒酶B、IFN-γ和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的水平明显高于稳定状态患者[16]。

为了进一步提高移植肺长期存活率、诱导抗原特异性免疫耐受，早期鉴别和诊断排斥反应是迫切需要解决的难题。气管镜活组织检查（活检）病理学分级是诊断的金标准，但存在有创性、采样误差和观察者间变异性等的限制，目前研究者们正在探索灵敏度高和有效性强的细胞、分子等多种标志物。

3 肺移植病原体感染的快速诊断

感染可影响肺移植受者的短期和长期生存，应用免疫抑制剂以及移植肺的去神经化可导致肺移植受者咳嗽反射受损[17]。肺移植受者存在来自供肺和气道传播的感染风险，并且术后的感染症状不甚明显，与排斥反应的鉴别存在困难，传统的病原体培养技术检测时间长，可能延误治疗，因此临床迫切需要早期预警和鉴别诊断病原体感染。

一项新近报道评估了150例肺移植受者感染病原体的分子诊断技术的性能，使用多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术监测了BALF中的26种下呼吸道病原体，实现了在支气管镜检查后平均3.8 h报告结果，而传统培养方法平均13 h报告病毒，平均48 h报告细菌[18]。该技术极大地缩短了病毒和细菌的报告时间，能够为感染诊断提供依据，利于临床的早期治疗，但存在假阳性，目前仍处于优化的研究阶段。

人类偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）和副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）感染是肺移植受者常见的社区获得性感染。Permpalung等[19]发现31.6%感染HMPV和PIV的肺移植受者在1年内肺功能恢复不良，预示与长期移植肺失功相关。免疫抑制状态与肺移植受者术后感染密切相关，Gardiner等[20]研究表明，肺移植受者术后血浆IFN-γ明显下降，且泼尼松龙剂量对血浆IFN-γ水平有显著影响。

2020年爆发的新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）疫情给肺移植带来了更大的挑战。Wu等[21]报道，2020年肺移植受者术后90 d生存率为85.7%，优于2019年的71.7%，表明肺移植可作为新冠肺炎重症患者中病毒学转阴患者的抢救性治疗。Hawkins等[22]分析了21例新冠肺炎相关肺病肺移植受者的资料，发现肺移植围手术期受者生存率为95%（20/21），总生存率为90%（19/21），表明双侧肺移植对新冠肺炎继发终末期肺衰竭患者是一种有效的治疗选择。但Kaul等[23]报道了1例从供者向受者传播新型冠状病毒的病例，尽管供者上呼吸道检测呈阴性，依然导致受者以及一名胸外科医师感染新型冠状病毒。

侵袭性真菌感染是实体器官移植受者术后1年内发病和死亡的主要原因。肺移植术后第1年肺真菌感染率为10.5%，病死率为38.0%。有研究分析55例儿童肺移植受者资料发现，29例移植前真菌定植，33例移植后真菌定植，其中11例发展为肺部真菌性疾病，真菌定植与肺部真菌性疾病不存在相关性[24]。

抗真菌预防治疗是肺移植受者术后常规护理方案，一般使用广谱抗真菌药物，而非靶向预防可以有效降低侵袭性肺曲霉菌感染的风险[25]。在肺移植术后免疫功能低下的受者中，梭状芽孢杆菌和小多梭孢菌定植可进展为危及生命的侵袭性疾病[26]。

4 肺移植术后其他重要并发症

原发性移植物失功（primary graft dysfunction，PGD）常见于肺移植术后早期，是肺移植受者术后死亡的主要原因之一，组织学上表现为弥漫性肺泡损伤，临床上根据动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）/吸入氧浓度（fraction of inspired oxygen，FiO2）和影像学浸润进行分级，0级为无病变，3级为严重PGD。Diamond等[27]分析了315例PGD受者血浆中血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang2）水平，发现Ang2可参与肺上皮损伤、细胞黏附和凝血等PGD分级相关过程，联合进行临床PGD分级可显著提高肺移植受者术后90 d病死率的预测价值。肺移植术后72 h内，PGD 3级发生率为30.8%，再灌注后48 h或72 h发生率为16.8%，PGD与术后90 d和1年病死率显著相关。PGD发生的根本原因仍未明确，可能与以下病理生理过程有关：（1）多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）活化是PGD进展的标志，即PMN从肺循环向间质和气道的迁移；（2）肺内皮细胞损伤是PGD进展过程中另一重要组成部分，AM活化可招募白细胞；（3）CD4+T细胞可启动与供者T细胞的细胞间通讯，参与PGD发展的后期阶段；（4）Toll样和NOD样受体以及细胞因子IL-1β等也参与PGD的进展[28]。PGD进展过程中，多种免疫途径与细胞因子释放增强密切相关，IL-1、IL-6和CC趋化因子配体4（CC chemokine ligand 4，CCL4）表达水平均升高，免疫受体相关的信号通路活化，释放大量促炎介质。供肺内IL-8水平、IL-17受体多态性与肺移植术后早期移植物衰竭相关。预防和减少PGD的发生策略包括术前优化供者的选择、匹配和管理，改进肺保存技术和再灌注技术。可溶性补体受体1抑制剂、纤溶酶原激活因子拮抗剂与外源性表面活性剂亦显示出有益的效果[28]。

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是肺移植围手术期常见的并发症，也是影响肺移植受者生存率及生活质量的独立危险因素之一。Testelmans等[29]研究显示，肺移植受者术后1年OSAS的发生率为73.8%，且以中重度为主。目前缺乏对肺移植术后并发OSAS的长期随访性研究，其发生机制并不明确，可能与以下因素有关：（1）终末期肺病本身及其致病因素，以及睡眠期间通气控制系统的敏感性或环路增益增加，呼吸化学感受器的敏感性改变及呼吸控制的不稳定性；（2）供、受者胸腔容积匹配不佳，引起通气血流比例失调及压迫心脏、纵膈等脏器，影响了上气道的稳定性，导致咽腔的塌陷；（3）肺移植术后受者体质量、药物作用及体内水分的转移等其他因素[30]。

5 肺移植相关基础免疫

肺移植的基础研究报道相对较少，伴随着基础免疫学理论的发展和生物技术的涌现，肺移植免疫学相关问题得到了重要的提示参考。利用单细胞测序等高通量、高精度的技术手段可精确阐述肺脏免疫应答的细胞和分子机制。

外泌体可参与机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化等过程，可能与其生物来源、物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布有关。研究报道，肺移植受者的外周血和BALF中存在外泌体，且其在正常和炎症状态下具有不同的RNA图谱[31]。外泌体表面存在不匹配的供者人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和肺相关组织限制性自身抗原，表明外泌体可能在诱导肺移植排斥反应中起重要作用。来源于供者树突状细胞的外泌体已被证明能促进同种异体移植物通过转移功能性抗原提呈细胞参与免疫应答，激活信号和供者HLA。外泌体可携带同种异体抗原、肺相关自身抗原、微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）、蛋白酶体、共刺激分子和促炎转录因子，通过直接、半直接和间接途径提呈抗原，对同种异体抗原和肺相关抗原产生免疫反应。外泌体具有高生物安全性、低抗原性等优势，有望在排斥反应的诊疗、免疫耐受的诱导中发挥潜在的价值。

随着基础学科的深层次交叉与渗透，可实现动态观察肺组织免疫细胞之间、免疫细胞与基质细胞、免疫细胞膜受体与可溶性配体等的调控网络，基础免疫学研究将揭示肺移植免疫学领域的问题，但目前肺移植免疫学的特异性尚未明确，其致病机制有待进一步探索。

6 小结与展望

为进一步改善肺移植受者和移植肺的长期存活，晚期慢性移植肺失功和感染等的防治工作任重道远。探索肺移植受者免疫系统的变化规律是临床和基础研究的重要策略，围绕肺移植受者体内多种免疫细胞的迁移、聚集、分布和相互作用等，发现肺移植免疫（黏膜免疫等）的关键机制。首先，建立排斥反应的早期预警和鉴别诊断体系仍然是重点工作，研究肺组织区域免疫细胞组成的特异性、异质性和复杂性，有利于在发生排斥反应时对细胞群体的全面分析和功能评价；其次，有必要建立快速诊断病原体感染的方案，以保障临床选择诊疗策略的及时性，利用新一代测序技术精准筛选病原体种类，并结合组学大数据、各种单细胞技术、成像新技术等，实现快速获得病原体感染的信息。