顺9，反11-共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子的影响

■张 航 张腾龙 王雨琼 魏曼琳 牛化欣

（1.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

乳腺炎是导致奶牛产奶量和乳品质下降的一种疾病，严重影响奶牛生产效益。当前主要使用抗菌药物治疗奶牛乳腺炎，但其易产生耐药性、药物残留等问题，所以寻找天然药物尤为重要。共轭亚油酸（Conjugated linoleic acids，CLA）是具有共轭双键的亚油酸的位置和几何异构体的总称。在CLA 的同分异构体中，c9，t11-CLA 和t10，c12-CLA 是最主要的两种。共轭亚油酸作为一种长链不饱和脂肪酸，参与机体内一系列生理活动，具有抗癌、抗炎、降低体脂、调节血糖、提高免疫力等诸多重要的生理学功能。

CLA的抗炎作用已被广泛报道。研究发现，CLA能够通过免疫抑制炎性因子的产生和预防免疫诱导改变免疫应答[1-2]，可以通过调控免疫应答和免疫细胞因子影响宿主免疫调节，延缓机体免疫能力的衰退[3-4]。在小鼠胶原诱导关节炎模型中添加c9，t11-CLA 可有效减少肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）的产生，降低关节炎的严重程度[5]。日粮中添加CLA可显著增加抗炎细胞因子白介素（IL-10）的mRNA 表达水平，促进抗炎细胞因子的产生[6]。研究表明，CLA 可以调节参与炎症反应相关细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的产生[7]。但CLA对奶牛乳房炎是否有一定的作用还不清楚，因此本研究以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为体外模型，通过添加不同浓度的c9，t11-CLA确定其对细胞增殖和炎症细胞因子的影响，为进一步探讨CLA的抗炎机制和开发新型奶牛乳腺炎预防药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BMECs 由内蒙古农业大学动物营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室通过组织块培养法分离鉴定所得。DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、胰岛素转铁蛋白溶液、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶/EDTA 和双抗（均由GIBCO公司提供）；氢化可的松、表皮生长因子、催乳激素（均由SIGMA公司提供）；PBS溶液（HyClone公司）、两性霉素（AMRESCO 公司）；无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（Equitech-Bio 公司）；RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（天根生化科技有限公司）；Prime⁃Script RT Master Mix 和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa公司）；CCK-8活力检测试剂盒（Dojindo分子技术公司）；TNF-α、IL-6、白介素8（IL-8）、IL-10活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1 c9，t11-CLA对BMECs增殖能力的影响

c9，t11-CLA由无水乙醇溶解，用0.22 μm的无菌滤器过滤后分装于10 mL 无菌离心管。临用前用DMEM/F12完全培养基稀释成工作浓度。

取对数生长期的BMECs 用0.25%胰酶消化计数后，每孔按4×104个/mL的细胞密度接种于96孔板中，加入含有不同浓度（0、50、100、200、400、800 μmol/L）c9，t11-CLA的DMEM/E12 培养液，在37 ℃的5% CO2培养箱中处理24 h，再将每孔中加入10 μL的CCK-8试剂继续培养4 h，用酶标仪检测450 nm 波长下的OD值。每组6个重复，结果取平均值。

1.2.2 c9，t11-CLA对BMECs炎症因子的影响

取对数生长期的BMECs 用0.25%胰酶消化计数后，每孔按1.0×105的细胞密度接种于6孔板中。试验分为0、50、100、200 μmol/L 4个浓度处理组。将细胞培养24 h 后，收集细胞培养液上清，按照ELISA 试剂盒的指示操作，测定BMECs 中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的浓度。每个样品重复6次，取平均值。

1.2.3 c9，t11-CLA对BMECs促炎因子mRNA表达量的影响

同上述方法1.2.2 收集细胞和试验分组，按照总RNA 提取试剂盒的说明书提取细胞总RNA。经酶标仪检测RNA 的浓度和纯度后用TaKaRa 试剂盒反转录成cDNA，-80 ℃保存备用。按照SYBR Green 试剂盒检测促炎基因的mRNA 表达水平。PCR 反应条件为：实时荧光定量PCR 的反应程序为：95.0 ℃预变性30 s；95.0 ℃变性30 s，Tm退火20 s，72.0 ℃延伸30 s，40个循环。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并将PCR 扩增产物送至上海生物生工进行测序。引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 所测基因的引物序列[8]

1.3 数据分析

首先通过Excel 2010软件对数据进行整理，随后采用SAS 9.0 软件包中的单因素方差分析（one-way ANOVA，LSD）对试验数据进行分析，用Duncan’s 法进行多重比较。所有试验均重复3 次，数据均用“平均值±标准差”表示。P<0.05 表示差异显著。用2-ΔΔCt计算基因mRNA相对表达量。

2 结果与分析

2.1 c9，t11-CLA对BMECs增殖能力的影响（见图1）

图1 不同浓度c9，t11-CLA对BMECs增殖的影响

由图1 可知，不同浓度的c9，t11-CLA 对BMECs的增殖效果不同。与对照组相比，50、100 μmol/L 和200 μmol/L c9，t11-CLA对乳腺上皮细胞增殖能力有一定的促进作用，而400 μmol/L 和800 μmol/L c9，t11-CLA 时细胞增殖能力显著降低（P<0.05），所以选用50、100 μmol/L 和200 μmol/L c9，t11-CLA 进行后续试验。

2.2 c9，t11-CLA对BMECs炎症因子的影响（见图2）

由图2可知，不同浓度的c9，t11-CLA对BMECs中促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10含量没有显著影响（P>0.05）。与对照组相比，添加200 μmol/L c9，t11-CLA显著降低促炎细胞因子IL-8和TNF-α含量（P<0.05），添加50 μmol/L 和100 μmol/L c9，t11-CLA 显著增加促炎细胞因子TNF-α含量（P<0.05）。试验结果表明，c9，t11-CLA 对BMECs 的抗炎作用可能存在一定的剂量选择性。

图2 不同浓度c9，t11-CLA对BMECs炎症因子的影响

2.3 c9，t11-CLA 对BMECs 促炎因子mRNA 表达量的影响（见图3）

由图3 可知，不同浓度c9，t11-CLA 对IL-6 的mRNA 表达量无显著影响。与对照组相比，添加100 μmol/L 的c9，t11-CLA 可以显著提高IL-8 的mRNA表达量（P<0.05），200 μmol/L的c9，t11-CLA显著降低IL-8和TNF-α的mRNA表达量（P<0.05）。

图3 不同浓度c9，t11-CLA对BMECs促炎因子mRNA表达量的影响

3 讨论

奶牛乳腺炎是危害奶牛健康的发生率最高的疾病之一，严重影响了乳产量和乳品质。所以，找到高效无毒的乳腺炎治疗药物成为畜牧兽医科研人员的研究热点。CLA 作为一种天然存在于生物体内的极具应用价值的功能性脂类物质，有着抗炎、抗氧化、提高免疫力等作用，但其作用剂量和机制等还不清楚。

本研究初步进行了c9，t11-CLA对BMECs抗炎作用剂量的探索。研究结果显示，添加200 μmol/L c9，t11-CLA显著降低BMECs促炎细胞因子IL-8和TNF-α的含量及mRNA 表达量，100 μmol/L 的c9，t11-CLA显著提高TNF-α的含量和IL-8 的mRNA 表达量。细胞炎症因子可以提供一种快速、可靠和高灵敏度的检测手段，因此炎症因子的表达与调控已成为当前炎症相关研究的热点之一。IL-6 促进中性粒细胞和单核细胞的趋化转移，可以降低中性粒细胞的有害作用和免疫机制的发生[8]。IL-8 是趋化家族的因子，对中性粒细胞有细胞趋化作用而实现其对炎症反应的调节。TNF-α是炎症感染早期产生的最主要细胞因子，可以帮助宿主抵抗感染[9]，与大肠杆菌引起的急性乳房炎有关[10]。Yu等[11]研究发现，CLA在小鼠的巨噬细胞中可以降低TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA 表达量。Dipasquale 等[12]研究发现，LPS 诱导BMECs 产生炎性反应后，添加50 μmol/L的c9，t11-CLA可以显著降低促炎性因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10 的mRNA表达量。本研究结果显示，添加50 μmol/L c9，t11-CLA 显著提高了BMECs 促炎性因子TNF-α的含量，对IL-6、IL-8、TNF-α的表达量没有显著影响。

4 结论

本研究通过比较不同浓度c9，t11-CLA对BMECs中细胞炎症因子含量和mRNA 表达量，确定200 μmol/L c9，t11-CLA 显著降低BMECs 中促炎因子IL-8 和TNF-α含量和mRNA表达量，表明该浓度对促炎细胞因子有明显的抑制作用，该结果可为研究c9，t11-CLA对BMECs抗炎作用机理提供数据支撑。