胡麻/小麦间作与胡麻-小麦轮作对土壤理化特性及胡麻生长的影响

王立光, 叶春雷, 陈军, 李进京, 罗俊杰

(甘肃省农业科学院生物技术研究所, 兰州 730070)

在一块土地上连续种植同种或近缘作物会使土壤环境恶化，导致下茬作物长势变差、产量和品质降低，这种现象被称为连作障碍[1-3]。连作障碍已成为困扰农业生产的一个焦点问题，备受国内外学者的关注。不同作物对连作的耐受性有较大差异，有的作物连作二至三年就会表现出明显的连作障碍，而有的作物则需要连作数年甚至十数年才出现连作障碍[4-6]。目前研究认为,土壤理化性质、土壤微生物群落及自毒作用是引发连作障碍的主要因素，且这些因素均通过土壤对作物产生影响[7-10]。在农业生产过程中，人们发现采用间作和轮作是防止连作障碍发生的种植模式，能有效改善农业生态，实施合理的间作和轮作制度有利于农业生产的可持续发展[11-17]。

胡麻(Linumusitatissimum)为一年生草本油用纤维作物，是我国西北和华北黄土高原地区重要的油料作物。胡麻的品种选育、产业深加工和胡麻油的利用等方面已经取得一系列科研成果[18-24]。在长期农业生产中，农户发现在同一块土地上连续种植胡麻两年后，第三年继续种植胡麻会导致产量显著降低；而利用间作或轮作的种植模式后，可以明显改善这种连作障碍。研究表明，胡麻连作两年会导致土壤水提液的自毒作用明显加强，抑制种子萌发、影响植株生长，同时还会降低土壤酶活性，而间作或轮作可以有效缓解这些不利影响[25-26]。目前，关于缓解胡麻连作障碍的研究虽然已经取得一些成果，但是引入小麦与胡麻进行间作或轮作，对于改善土壤理化性质、减少自毒作用及对微生物群落等的影响，仍需要设置详细的大田试验，通过对比研究以期获得进一步的试验证据。因此，本研究于甘肃省内低、中位山旱地设置试验点，研究胡麻连作(净作)、胡麻/小麦条带间作和胡麻-小麦轮作对土壤理化性质、土壤酶活性、土壤自毒作用及下茬胡麻生长和产量的影响，探索引入小麦开展间作或轮作，打破胡麻连作障碍的机制，优化胡麻与小麦轮作或间作的栽培模式，为胡麻高产高效栽培及区域农业资源的可持续利用提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取甘肃省农业科学院选育的胡麻品种陇亚10号为试验材料，该品种具有抗旱、抗倒伏、高抗枯萎病的特性，高度适于甘肃省低、中位山旱地种植；选取小麦品种陇春20号为间作或轮作材料，由甘肃省农业科学院小麦研究所提供。

1.2 试验设置

试验地点位于甘肃省榆中县良种厂(E 104°06′、N 35°50′), 海拔高度约1 600 m。分别设置胡麻连作两年(CC2，连续种植胡麻两年；第三年继续种植胡麻记作CC3)、胡麻/小麦间作(CI，第一年种植胡麻，第二年胡麻和小麦间作，第三年仍为胡麻和小麦间作)和胡麻-小麦轮作(CR，第一年种植胡麻，第二年小麦轮作，第三年再次种植胡麻)3种种植模式，每个处理重复3次，采用随机区组设计，每个小区面积27 m2(4.5 m×6.0 m)。小区之间采用高50 cm、宽60 cm的土埂间割。每小区胡麻种植时每行播种量相同。均于第三年种子萌发一个月后测定株高，之后每隔1月测量一次，直至收获。收获后测定胡麻单株产量、千粒重及小区产量。

1.3 土样采集

试验第二年，于收获后分别对胡麻连作两年、胡麻-小麦间作和轮作后的根际土壤呈“S”型布点进行采集，保证每小区至少10～12个采样点，将采集后的土壤充分混匀，剔除枯叶、腐叶后一部分土样用于土壤理化性质、酶活性及微生物群落测定，剩余部分用于水提液的制备。

1.4 土壤酶活性测定

参照王立光等[27]的方法，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性；采用磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性；采用高锰酸滴定法测定过氧化氢酶活性；采用靛酚蓝比色法测定脲酶活性。

1.5 土壤水提液制备及自毒作用测定

土壤水提液制备及自毒作用测定参照王立光等[27-28]方法，具体为：称取60 g样品放入棕色试剂瓶内，加入蒸馏水600 mL，充分震荡混匀后置于摇床振荡提取48 h后，过滤获得浸提液母液(100 mg·mL-1)置于4 ℃冰箱保存。选取大小均一的陇亚10号种子，20%次氯酸钠消毒13～15 min，灭菌蒸馏水漂洗至少6～8次后，均匀摆放在铺有两层滤纸的无菌培养皿中，每皿40粒，对应皿中加入相应浓度的提取液8 mL, 对照组利用蒸馏水(CK)替代，每处理3次重复。培养皿置于光暗各12 h、25 ℃恒温的培养箱内，以胚根突破种皮作为种子萌发的测定标准。试验中，每隔1 d加入3 mL对应浓度的提取液，用于保持滤纸湿润，每隔24 h统计一次发芽粒数；并于第3天统计发芽势(germination potential, GP)；第7天统计发芽率(germination rate，GR)和发芽指数(germination index，GI)；挑选10株第1天开始萌发的幼苗，测定株高(shoot length，SL)、根长(Root length，RL)、苗鲜重(shoot weight，SW)和根鲜重(root weight，RW)。计算各处理的发芽指数和活力指数(vigor index，VI)，并计算各指标的化感作用抑制率(response index，RI)，从而计算得到综合效应(synthesis effect，SE)。

1.6 土壤微生物群落结构测定

土壤样品为混合土样，将每处理的3个重复土样充分混合，用四分法取适量土样置于自封袋内，用干冰保存，带回实验室进行后续分析。准确称取0.1 g土样，按照土壤微生物DNA提取试剂盒(MOBIO,12888-100)说明书步骤，分别提取土样的总DNA，Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，合格样品交由美吉生物医药科技公司进行细菌和真菌测序。

1.7 数据处理和分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行原始数据的整理和分析，通过SPSS 20.0软件进行单因子方差分析，用新复极差法(Duncan)进行显著性分析，利用Adobe Photoshop和Sigmaplot 10.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作对土壤理化性质的影响

表1表明，CI和CR土壤pH、有机质、有效磷、速效钾、全氮、全磷和全钾含量均显著低于CC2；CR土壤的pH、有机质、有效磷和速效钾含量又显著低于CI，全氮、全磷和全钾含量与CI差异不显著；而CR土壤碱解氮含量最高，CC2次之，CI土壤中的碱解氮含量最低。由此可见，三种种植模式下土壤养分表现为CC2>CI>CR，说明连作导致土壤碱化，降低了土壤肥料利用率，而间作和轮作不同程度地缓解了土壤的碱化程度，加强了作物对土壤有机质及磷肥和钾肥的利用。

表1 不同处理土壤的基本理化性质

2.2 胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作对土壤酶活性的影响

第二年收获后测定土壤酶活性,结果(图1)表明，CI和CR土壤的酶活性高于CC2。其中，土壤蔗糖酶活性表明，CI和CR与CC2的土壤蔗糖酶活性均无显著差异。土壤脲酶活性表现为CR中活性最高，较CC2显著增加15.4%；而CI与CR、CC2差异不显著。过氧化氢酶活性在不同种植模式下表现为：CR土壤中活性显著高于CI，较CI提高7.1%；而CI土壤中过氧化氢酶活性又显著高于CC2，较CC2提高4.2%，即：CR>CI>CC2。CI与CC2土壤的碱性磷酸酶活性相似，无显著差异，均显著低于CR。

注：不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平显著。

2.3 胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作对土壤化感效应的影响

不同种植模式的土壤水提液对胡麻影响的综合效应为：CR>CI>CC2(图2)。CR土壤水提液综合效应为0.21%，表现出微弱的促进作用；CI土壤水提液综合效应为-0.77%，表现出微弱的抑制作用；而CC2土壤水提液综合效应为-6.61%，表现为较强的抑制作用。由此说明，与小麦间作或轮作均不同程度消减了土壤的自毒效应，而连作种植胡麻使土壤产生较强的自毒作用。

注：不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有显著性。

2.4 胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作对土壤微生物群落的影响

基于细菌16S rDNA和真菌ITS的高通量测序结果(图3)表明，CI和CR土壤细菌群落的Shannon指数与CC2间无显著差异；而CR土壤真菌群落的Shannon指数(3.37)显著低于CI(4.11)和CC2(4.07)。由此表明，与连作相比，间作和轮作小麦后土壤细菌群落的多样性差异较小，但轮作降低了土壤真菌的多样性。

注：不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平显著。

对土壤细菌分析(图4)发现，CI、CR和CC2土壤细菌分别涉及33、35和34个门类，其中有32个细菌门类为三者共有；CI和CR中检测到的衣原体门(Chlamydiae)在CC2土壤中未检测到；而CR和CC2土壤检测到的GAL15菌门和Peregrinibacteria菌门在CI土壤中未检测到。对土壤细菌优势菌门分析表明，CI和CR与CC2土壤内相对丰度排名前六的优势菌均相同，依次为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿湾菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。这6类优势菌门的相对丰度均占各土壤细菌的80%以上；但不同土壤内各优势细菌门的相对丰度存在差异。变形菌门在CI和CR土壤内的相对丰度较为接近，分别为24.9%和24.5%；而在CC2土壤内的相对丰度为28.4%。酸杆菌门在CR土壤内相对丰度为29.1%;而在CI和CC2土壤内的相对丰度均为20.9%。放线菌门在各土壤内的相对丰度为：CI(19.2%)>CC2(13.6%)>CR(9.9%)。绿湾菌门在各土壤内的相对丰度较为一致，分别为11.9%(CI)、11.2%(CR)和10.9%(CC2)。拟杆菌门在各土壤内的相对丰度情况与变形菌门相似，在CC2土壤内为10.8%，高于CI(6.9%)和CR土壤(7.0%)的相对丰度。芽单胞菌门在CC2土壤内的相对丰度为4.4%，低于CI(5.6%)和CR土壤(6.2%)。聚类分析表明，CI和CC2土壤细菌群落的相似度较高，而与CR土壤细菌群落结构差异较大。

真菌测序结果(图4)表明，三种土壤中真菌均来自于6个门，分别为子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和真菌界下未分类门(unclassified-k-Fungi)。其中，优势菌群为子囊菌门，在各处理土壤内真菌群落分别占75.6%(CI)、57.3%(CR)和67.5%(CC2)。CR土壤内真菌界下未分类菌门占比(24.0%)显著高于CI(6.8%)和CC2(8.3%)土壤。接合菌门在各处理土壤内占比相近，分别占真菌群落的10.9%(CI)、13.0%(CR)和11.2%(CC2)。担子菌门和球囊菌门在CC2土壤内的占比分别为11.2%和1.2%，显著高于CI(6.4%和0.1%)与CR(5.2%和0.2%)。壶菌门在三种土壤内的占比均为最低。真菌聚类结果与细菌聚类结果一致，CR土壤真菌群落结构与CI和CC2差异较大，而CI和CC2土壤真菌群落的相似度较高。

图4 土壤中细菌和真菌群落的β多样性分析及丰度变化

以上结果表明，种植模式导致土壤生态系统中的细菌和真菌群落的组成及比例发生变化。

2.5 胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作对后茬胡麻生长及产量的影响

与CC3相比，CI和CR有利于下茬胡麻的生长和高产，轮作效果优于间作(图5)。对第三年胡麻生长过程测定表明，萌发至两个月内的胡麻株高在各处理间无显著差异；但之后至收获，CC3株高显著低于CI和CR，且CR又显著高于CI。收获期CR和CI后再植胡麻的株高分别比CC3株高增加16.3%和7.7%，CR比CI增加7.9%。籽粒千粒重及产量比较表明，连作导致单株产量和千粒重明显降低，而CI和CR间的胡麻籽粒千粒重无显著差异，均较CC3千粒重增加51.0%左右；CR处理后再植胡麻的单株产量较CI增产24.0%，较CC3增产81.3%，CI处理后再植胡麻的单株产量较CC3增产46.2%。由此表明CI处理后种植胡麻的结实率可能低于CR。小区产量也表现出与单株产量相同的趋势，即CR>CI>CC3，CR和CI的小区产量分别是CC3小区产量的1.68和1.36倍。

注：不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平显著。

3 讨论

间作和轮作倒茬是农业生产中用地养地相结合的有效措施，研究表明，合理的间作或轮作可以协调作物间养分吸收，增加土壤的养分，提高土壤酶活，减弱自毒效应，改善微生物群落结构，从而消减连作障碍的影响[6, 16, 29-32]。土壤pH是影响土壤肥力的重要因素之一，对作物生长具有重要影响，过酸或过碱均不利于作物生长，连作会使土壤pH升高或降低[17, 33-34]，而间作和轮作具有稳定土壤pH的作用。张月萌等[31]研究发现，间作苜蓿或三叶草可以使土壤pH在山药根茎膨大初期和盛期显著低于连作土壤；但冯世鑫等[34]对黄花蒿研究发现，黄花蒿与作物轮作的土壤pH高于连作土壤。本研究显示，胡麻-小麦间作或轮作后土壤pH低于连作土壤，说明胡麻连作有使土壤碱化的趋势，而间作缓解了这一趋势，轮作的作用则更加显著，这很可能是消减胡麻连作障碍的一个重要因素。张月萌等[31]研究表明，间作苜蓿和三叶草使土壤中硝态氮、速效钾和速效磷含量高于连作土壤[31]；剡斌[35]研究显示，胡麻与小麦、马铃薯轮作提高了0—60 cm土层土壤有机质、全氮和速效磷含量，却降低了该土层土壤全磷和铵态氮含量。本研究与前人结果存在一定差异，胡麻-小麦间作或轮作后土壤有机质、全磷、全钾、全氮、有效磷和有效钾含量与连作土壤相比均呈逐渐下降趋势，与万年鑫等[36]对马铃薯连作的研究结果相一致。造成这种趋势的原因可能是胡麻连作导致土壤环境发生变化，从而不利于胡麻根系对营养物质的吸收利用，导致连作土壤内有机质含量较高；而胡麻-小麦间作或轮作使得作物可以充分吸收利用土壤中的营养物质。这也暗示，连作障碍并不能依靠施用化肥来消减，化肥的过度使用可能会对胡麻生产造成进一步的不利影响。由此表明，土壤理化性质的改变不仅受栽培方式的影响，还与种植的作物相关。因此，对不同作物的栽培模式及间作或轮作作物的选择要根据情况来选择。

土壤酶活性是土壤质量的表征，也是土壤健康评估的主要参数[37]。间作研究发现，与番茄单作相比，番茄与架豆、地豆、苋菜间作均可提高土壤蔗糖酶和磷酸酶活性；与架豆和地豆间作还可以提高土壤脲酶活性；与地豆和苋菜间作可降低土壤过氧化氢酶活性[38]。张月萌等[31]研究发现，山药间作苜蓿或三叶草可提高土壤脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性。轮作也可提高部分土壤酶活性，从而提高土壤肥效，如马铃薯与玉米轮作可提高土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性[36]。王丽红等[39]用小麦和豌豆与马铃薯轮作发现，马铃薯与豌豆轮作使马铃薯成熟期土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性升高；而马铃薯与小麦轮作仅使土壤蔗糖酶活性升高。本研究利用小麦与胡麻间作发现，收获期土壤中过氧化氢酶活性显著升高；而小麦与胡麻轮作使土壤脲酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶活性均显著高于连作土壤。由此表明，土壤酶活性的改变不仅和种植模式有关，也受轮作或间作作物及生长时期的影响。

自毒作用被认为是导致连作障碍的主要原因之一。作物通过根系分泌、淋洗和残体分解等方式使有毒物质进入土壤。郭俊霞等[40]研究表明，丹参连作的土壤水提液对幼苗生长和生理指标均有不同程度的抑制作用。黄钰芳等[41]研究显示，百合连作的土壤水提液对幼苗有明显的抑制作用。也有研究证明，随百合连作年限增加，邻苯二甲酸等植物毒性化感物质在土壤中积累，导致毒害[42]。本研究显示，胡麻连作的根际土壤水提液对胡麻的综合效应为抑制作用，而胡麻与小麦间作使抑制作用明显减弱，胡麻与小麦轮作则表现为促进作用。这表明与连作相比，间作和轮作使自毒作用减弱，自毒物质的积累量相应降低，有利于下茬胡麻的生长。因此，在生产中通过人为干预土壤内自毒物质的积累，有利于胡麻连作障碍的消减。

细菌、真菌和放线菌是土壤微生物的主要菌群。谭雪莲等[43]发现马铃薯连作后土壤内细菌和放线菌的数量随连作年限的增加而下降，真菌数量则上升。王丽红等[39]研究发现，马铃薯连作后，土壤内细菌和真菌数量均随连作年限的增加而降低；而采用小麦、豌豆等与马铃薯轮作可以提高土壤内细菌和放线菌数量，降低真菌数量。高林等[44]发现，烤烟连作后土壤细菌的Shannon指数和Chaol指数随着连作年限的增加均呈现下降趋势；而土壤真菌的Shannon指数呈上升趋势；且菌落结构组成也发生了较大变化。本研究显示，胡麻和小麦间作或轮作使土壤内细菌和真菌的群落结构组成与连作土壤有明显差异，与前人的研究结果一致；但土壤内细菌多样性无显著变化，推测可能是由于胡麻连作年限较短，对细菌的影响较小，这一现象与孙秀山等[45]及殷继忠等[46]对花生和大豆连作研究结果相似。除此之外，本研究发现胡麻与小麦轮作对土壤真菌群落多样性的影响明显大于间作，这可能是由于间作存在部分胡麻持续作用的结果。

连作障碍表现为植物生长发育状况变差、产量下降、品质降低。而合理的间作或轮作可以消减连作障碍的发生。姚虹等[47]研究发现，胡麻连作后保苗率、平均株高、单株蒴果数和千粒重等都低于轮做。陈军等[48]通过对收获期胡麻株高及产量研究发现，间作可以在一定程度上消减连作带来的负面效应，轮作可以有效消减连作危害。另外豆科与番茄间作也表明，间作可以使番茄的株高和产量增加[38]。这些结果与本研究结果相一致，表明胡麻/小麦间作和胡麻-小麦轮作均可消减连作障碍对胡麻生长和产量的负面影响，且轮作效果优于间作。但间作或轮作消减连作障碍的机理还需要进一步研究。