夹竹桃花不同溶剂提取物的GC-MS分析及其抗氧化、抑菌活性

曹乃馨，罗阳兰，解修超*，阎 勇，邓百万

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007)

夹竹桃NeriumindicumMill.是夹竹桃科夹竹桃属常绿直立大灌木，其叶、皮、根、茎、花中含有强心苷类、甾体类、萜类、香豆素类、黄酮苷类等多种活性化合物，具有灭螺、杀虫和化感作用，还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、强心的功效，但易引起中毒[1-8]。目前对夹竹桃的研究主要集中于强心苷、生物碱类、多糖等化学成分、药理活性及药物开发、生物防治及环境修复等方面[9-10]。

李昌灵等[11]研究了夹竹桃叶不同提取液的抑菌作用，发现醇提取液的抑菌效果最好，水提取液较弱，醚提取液最弱。董道青等[12]研究了夹竹桃叶五种有机试剂提取物对福寿螺的毒杀作用，发现正己烷提取物的毒杀活性最高，甲醇提取物的毒杀活性最低。研究发现夹竹桃叶具有一定的生物活性，但对夹竹桃花的研究鲜见报道，为明确夹竹桃花的生物活性以及不同溶剂提取物的效果，本研究以石油醚、二氯甲烷、无水乙醇和乙酸乙酯四种有机试剂为溶剂，用索氏提取法提取夹竹桃花的化学物质，通过GC-MS进行组分分析，并比较其抗氧化和抑菌活性，旨在筛选出高活性、低成本的提取溶剂，探索夹竹桃花的潜在药用价值，为夹竹桃花的深入研究和综合开发提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 N100O型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SW-CJ-1D型单人超净工作台(上海苏净实业有限公司)；YXQ-LS-50S型高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；Epoch2微孔板分光光度计(美国BioTek公司)。

1.2 材料 夹竹桃花采自陕西省汉中市城固县(北纬N33°09′24″，东经E107°20′00″)，40 ℃恒温干燥至恒重，粉碎过40目筛保存于阴暗处备用。碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，批号CMCC63501)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，批号CMCC26003)；大肠杆菌(Escherichiacoli，批号CMCC44102)；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，批号CMCC10104)；白色念珠菌(Candidaalbicans，批号CMCC98001)。

2 方法与结果

2.1 提取物制备 称取药材粉末10 g(M)，以石油醚(60～90 ℃)、二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯为溶剂，索氏提取3 h，合并提取液，减压浓缩得到提取物，在40 ℃下干燥至恒重后，称定质量(m)，计算得率，公式为得率=(m/M)×100%。结果，提取物得率分别为7.19%、5.97%、5.96%、4.33%，均有夹竹桃花芳香，其中石油醚提取物为深绿黏稠物质，二氯甲烷提取物为深绿固体物质，无水乙醇提取物为棕绿色固体物质，乙酸乙酯提取物为浅绿固体物质。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 供试品溶液制备 用正己烷配制质量浓度为10 mg/mL的提取物溶液，量取10 mL于圆底烧瓶中，加1 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL，40 ℃振荡30 min，静置15 min后70 ℃水浴蒸干，加5% H2SO4-CH3OH溶液4 mL，70 ℃振荡60 min，加正己烷5 mL，充分振荡后静置1 h，取上清液4 mL，无水硫酸钠干燥后取上清液2 mL，正己烷定容至10 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得[13]。

2.2.2 色谱条件 7890A-5975C型毛细管色谱柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；程序升温(初始温度50 ℃，保持2 min，3 ℃/min升至180 ℃，保持4 min，5 ℃/min升至210 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；载气氦气(99.999%)，体积流量1 mL/min；进样量1 μL；进样温度220 ℃，检测器温度250 ℃；分流进样，分流比20∶1。

2.2.3 质谱条件 EI离子源70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟时间3 min；全扫描采集模式，质量范围m/z45～550。

2.2.4 成分分析 利用Nist17 s.Lib标准质谱图库和文献解析，结合保留时间确认化学成分，按峰面积归一化法进行计算。结果见图1、表1。由此可知，石油醚(A)、二氯甲烷(B)、无水乙醇(C)、乙酸乙酯提取物(D)中分别有30、58、52、62个化合物，共有成分是正十九烷、十七烷、癸酸甲酯、10-甲基十九烷、正二十七烷、正二十八烷、3-羟基十六烷酸甲酯、十四酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、山嵛酸甲酯、β-香树脂醇、α-香树脂醇，分别占比69.17%、69.44%、64.11%、62.75%。

图1 提取物GC-MS图

表1 提取物成分GC-MS分析结果

续表1

续表1

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 还原能力 以Trolox为阳性对照，结果见图2。由此可知，4种溶剂提取物均有一定还原能力，依次为无水乙醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>乙酸乙酯提取物；在质量浓度为5 mg/mL时，四者还原能力分别为3.41、1.08、1.04、0.88 mmol/L。

图2 4种溶剂提取物的还原能力

2.3.2 DPPH自由基清除能力 以Trolox作阳性对照，参考王寒等[14]报道的方法测定，结果见图3。由此可知，4种溶剂提取物对DPPH自由基均有一定清除作用，并随着其质量浓度升高而增强，依次为无水乙醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>乙酸乙酯提取物。

图3 提取物对DPPH自由基的清除能力

2.3.3 羟自由基清除能力的测定 以Trolox作阳性对照，参考罗阳兰等[15]报道的方法测定，结果见图4。由此可知，4种溶剂提取物对羟自由基均有一定清除作用，其中石油醚提取物随其质量浓度升高而明显增强，乙酸乙酯提取物较趋于平缓，在质量浓度为5 mg/mL时，四者对羟自由基的清除率分别为51.22%、42.16%、50.82%、48.24%。

图4 提取物对羟自由基的清除能力

2.4 抑菌活性研究 将靶标菌活化后，调制菌液浓度为1.0×106～1.0×107CFU/mL，采用滤纸片扩散法[16]考察抑菌活性，二倍连续梯度稀释法[17]测定最小抑菌浓度(MIC)，平板转种法测定最小杀菌浓度(MBC)，结果见图5、表2～3。由此可知，阴性对照组无抑菌圈，表明20% DMSO对靶标菌的生长无抑制作用；含0.5%碘伏溶液的阳性对照组抑菌圈直径均大于15 mm，表明实验方法可行；质量浓度为5 mg/mL时，4种溶剂提取物周围均有抑菌圈，表明均具有一定抑菌活性；石油醚提取物对E.coli抑菌效果最好，而二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯提取物对B.subtilis抑菌效果最好。

表2 提取物对靶标菌的抑菌圈直径

3 讨论

本研究通过GC-MS分析发现夹竹桃花石油醚、二氯甲烷、无水乙醇和乙酸乙酯提取物中分别有30、58、52、62种化合物，四种溶剂提取物的13种共有成分分别占对应提取物的69.17%、69.44%、64.11%、62.75%。由此可见，不同溶剂之间提取物成分的种类及含量均有差异，主要是因为溶剂极性等性质的差异[18]。

注：1为石油醚提取物，2为二氯甲烷提取物，3为无水乙醇提取物，4为乙酸乙酯提取物，5为阳性对照，6为阴性对照。图5 提取物对靶标菌的抑菌圈

表3 提取物抑菌活性测定结果

夹竹桃花二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯提取物成分的研究鲜有报道，针对石油醚提取物与刘语等[19]的报道对比发现共有7种相同的物质，分别是癸醛、2,6,10-三甲基十二烷、十二醛、十四醛、十六醛、十五烷和十七烷，化合物及含量的差异可能与夹竹桃品种、甲酯化方法和仪器设备等有关。

由于四种溶剂提取物组分较为复杂，本研究仅进行成分的分析鉴定。其中，α-香树脂醇和β-香树脂醇是同分异构体，属于三萜类化合物，具有抑制脂肪细胞分化的作用，可作为新的治疗和预防肥胖的药物[20]。十四酸、十六酸等高级饱和脂肪酸，是自然界中分布最广的脂肪酸之一，几乎所有的油脂中都含有数量不等的软脂酸组分，十六酸具有抗肿瘤和抗衰老等活性[21]。癸酸等中链脂肪酸具有抑菌活性，癸酸具有较高的酸度系数，可以穿透细菌细胞壁、磷脂分子层和细胞膜[22]。亚油酸是人体自身不能合成但必需的功能性多不饱和脂肪酸代表物质之一，具有抗癌、抗氧化、增强免疫功能、降低血脂血压、软化血管、防止动脉粥样硬化及预防脂肪肝、抑制血栓形成的功效[23]。

抗氧化和抑菌结果显示，四种溶剂提取物均有一定的生物活性，这可能与提取物中化学成分及含量有关。无水乙醇提取物的生物活性最好，GC-MS分析发现相对含量较高的成分依次为α-香树脂醇(32.44%)、棕榈酸甲酯(17.33%)、亚油酸甲酯(10.01%)、油酸甲酯(8.2%)、γ-硫辛酸(5.07%)、硬脂酸甲酯(4.37%)、β-香树脂醇(3.3%)、癸酸甲酯(2.28%)。石油醚提取物的活性次之，相对含量较高的成分依次为α-香树脂醇(41.43%)、棕榈酸甲酯(12.13%)、十四醛(7.39%)、β-香树脂醇(7.23%)、8,11-十八二烯酸甲酯(3.79%)。结合提取物的得率，石油醚和无水乙醇是提取夹竹桃花活性成分比较理想的有机溶剂，可为新型抗氧化剂、新药等开发提供理论参考，为夹竹桃花的资源开发提供依据。