TLR4基因多态性及IL-6表达水平与慢性肾盂肾炎表型特征的相关性研究

韩 晶,黄凤丽

小儿肾盂肾炎是最常见的泌尿系统传染性炎性疾病，具有较高的急性发病率和长期肾脏损害，在肾脏间质参与炎症过程中，患儿的肾硬化风险极高，极易造成肾功能下降及早期残疾[1-3]。因此，为改善肾盂肾炎患儿的生活质量，急需发现特异性指标以实现肾盂肾炎的早期诊治。本研究通过探讨Toll样受体-4(TLR4)基因多态性与慢性肾盂肾炎表型特征及IL-6表达的相关性，以期发现肾盂肾炎的特异性指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2018年1月-2019年12月于本院小儿科住院治疗的60例加重期慢性肾盂肾炎患儿作为观察组，同期纳入95例健康儿童作为对照组，均进行临床及实验室检查。收集2组患儿的一般资料并进行统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.1 纳入标准：符合慢性肾盂肾炎相关性诊断标准[4]，并经X线、尿培养、尿常规及肾功能检查等确诊者；所有患者或其监护人均签署知情同意书；获得医院伦理委员会批准。

1.1.2 排除标准：合并严重心脑血管疾病者；理解或认知功能障碍者；肝肾功能严重损失者；接受相关免疫药物治疗者；患尿道综合征者；先天泌尿系畸形者；先天性免疫缺陷者。

1.2 方法

1.2.1 TLR4基因多态性检测：采集所有研究对象周围静脉血作为研究标本，从肘静脉取样到带有EDTA的无菌真空容器中，再与“ Dna-express”试剂一起引入eppendorf。使用寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)(试剂盒购自Thermo公司)进行Asp299Gly多态性部分的遗传分型。使用Tertsyk进行扩增。用PCR扩增TLR4基因的Asp299Gly多态性片段(上游：5′-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3′；下游：5′-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3′)。25 μl反应混合物包含2.5 μl 10×Buf用于扩增， 2 mM氯化镁，dNTP为0.2 mM，2.5个单位的DNA聚合酶标签，20-50 ng基因组DNA， 66 ng Asp299Gly引物。

1.2.2 IL-6表达水平检测：研究对象血清中IL-6含量的测定通过酶联免疫吸附(ELISA，Thermo公司)试剂盒检测。使用从肘静脉到无菌真空容器中取样的外周静脉血作为研究材料。治疗前和治疗结束时对IL-6浓度进行了两次分析。

1.2.3 常规指标检测：使用常规方法对所有研究对象进行一般的临床和实验室以及生化指标检测。肾小球滤过率(GFR)=48.4×身高(cm)/血液中肌酐含量(μmol/ L)，并校正了年龄和性别系数。尿液的细菌学研究包括检测微生物剂及其对抗菌和化学治疗剂的敏感性以及分子生物学研究[5](聚合酶链反应检测沙眼衣原体、解脲支原体、人支原体，研究材料为从尿道上皮刮擦的上皮细胞)，86.7%的患病儿童在处方抗菌治疗之前进行过治疗。

1.3 统计学方法：使用SPSS 22.0统计软件，使用标准χ2检查数据是否符合Hardy-Weinberg平衡，检查多形基因座的基因型分布。为了比较研究组之间的等位基因频率，对自由度等于1的人，使用具有连续性的Yates校正的Pearson准则2，对研究组之间的基因型频率进行比较。列联表使用Fischer精确检验。为了比较未连接组中变体的频率，确定95%置信区间(CI)，计算比值比(OR),以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4基因多态性分布情况：在大多数实际健康的儿童中(96.8%)，TLR4基因的AA等位基因AA呈正态分布(基因型为“野生型”)。杂合基因型AG的频率较低(3.2%)。慢性肾盂肾炎(CP)儿童的杂合子和突变基因型AG和GG的频率分别为86.7%和11.7%，并显著高于对照组的参数(χ2=5.78，OR=4.72，CI=1.2～8.56，P<0.05)。CP患儿中，突变等位基因299Gly的频率比健康儿童高4.4倍(χ2=5.78，P<0.05)。CP患儿的实际平均杂合水平为Asp299Gly(АG)，最低数量(1.6%)是纯合子Gly299Gly(GG)。

2.2 TLR4基因多态性与慢性肾盂肾炎表型特征的相关性：有TLR4基因多态性位点的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的患病儿童与“野生”基因型携带者相比，CP的早期表现风险(χ2=15.2,P<0.05)、长期复发形成的风险、泌尿综合征(χ2=4.0,P<0.05)和病情不稳定性(χ2=8.0,P<0.05)显著更高。突变基因299Gly携带者的平均复发频率为每年(3.8±0.2)次，而“野生基因型”儿童的复发次数较低，每年(1.1±0.2)次。血液中红细胞沉降率和带状中性粒细胞降低(分别为1.6倍和2倍)。有白细胞减少症(χ2=14.9,P<0.05)和感觉减退症(χ2=14.7,P<0.05)。具有TLR4基因多态性基因位点的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的儿童中，尿液中的白细胞数量超过没有这些基因多态性的儿童近30倍，并高于正常水平(P<0.05)。此类患者在CP加重期间还具有更明显的肾脏和排泄功能损害，尤其是昼间低脂血症的减少，相对尿密度的降低和肾小球滤过率下降。299Gly TLR4的存在与解脲支原体和人型支原体之间有相关性(τ=0.58)。与具有“野生”基因型的儿童相比，TLR4基因多态性位点的纯合子Gly/Gly和杂合子Asp/Gly患者的解脲支原体和人型支原体检测频率分别高11.7和5.9倍(P<0.05)。

2.3 TLR4基因多态性与IL-6表达相关性：在CP患儿中，IL-6的初始平均范围为(2.49±0.11)pg/ml至(33.35±7.7) pg/ml。CP患儿的IL-6平均值为(10.58±2.40) pg/ml，而健康儿童的平均值为(3.43±0.21) pg/ml，超出对照3.1倍以上(P<0.05)。不同TLR4受体基因型变异的患病儿童组中，与TLR4基因等位基因正常分布的患者相比，基因型AG的IL-6，GG TLR4的水平比相同参数低2.2倍，在缓解期仍然很高(P<0.05)。缓解期患者与TLR4等位基因突变分布(τ=0.74，P<0.05)，疾病频繁复发(τ=0.86，P<0.05)和尿毒症延长患者(τ=0.76，P<0.05)直接相关。

3 讨论

肾盂肾炎的发生发展及进程除取决于病原体特征外，还取决于个体特征(如患者的免疫反应)，这主要受其遗传因素影响[6-7]，近年来，随着分子生物学的发展，从基因层面预测患者的遗传为预后及病理发展提供了可能。由于TLR4在先天免疫系统防御机制中的重要作用，多项研究发现TLR4基因等位基因的存在会引起泌尿生殖道感染(如衣原体、支原体病、脲原体病、贾德氏菌病、滴虫)的风险增加[8]。基因多态性表明，可以从同一基因实现同一蛋白质的多个结构多样的拷贝，同时，部分拷贝的变体没有活性或可能具有相反的功能。控制有机体防御反应的基因差异可以在引入外源药物的情况下提供不同的炎症反应过程和特定的免疫反应过程特征，因此对慢性肾盂肾炎患儿单核苷酸替代的流行进行研究极为关键。

本研究结果表明，CP患儿TLR4多态性位点的杂合和纯合突变基因型AG和GG的频率与对照组相比显著增高。与“野生”基因型携带者相比，肾盂肾炎患儿中TLR4基因突变等位基因299Gly的存在与疾病的复发、病情不稳定、机体炎症反应的降低显著相关，CP急性加重期间尿道综合征持续时间延长，肾脏的浓度和排泄功能明显受损(P<0.05)。在患有慢性肾盂肾炎的患病儿童中，Asp299Gly，Gly299Gly TLR4基因的多态性与某些微生物有关。特别是与具有“野生”基因型的儿童相比，TLR4基因多态性位点的纯合子Gly/Gly和杂合子Asp/Gly的患者中解脲支原体和人型支原体的检出率增高了11.7和5.9倍。

在存在某些遗传先决条件的情况下，慢性肾盂肾病的患儿长期形成的IL-6反映了炎症过程的稳定活动[9]，通过基因组中TLR4突变等位基因299Gly的存在与水平升高之间的直接相关性证明病情加重或缓解期患病儿童白细胞介素6的水平(P<0.05)。同时，在患儿泌尿系统下部检测到解脲支原体和人型支原体，伴有促炎细胞因子浓度的升高(P<0.05)。