植物中吡咯里西啶生物碱的检测分析方法研究进展

朱 雷 花日茂 王路瑶 焦卫婷

（安徽农业大学资源与环境学院，安徽省农产品质量安全重点实验室，合肥 230036）

吡咯里西啶生物碱 （pyrrolizidine alkaloids，PAs）作为植物的次生代谢产物，是植物界为了保护自身免受捕食者侵害而产生的一类天然毒素，在世界各地不同地理环境中均有广泛的分布。PAs主要分布于开花植物中，目前，已在6 000多种开花植物中发现近660种不同结构的PAs[1]，这类生物碱多衍生自紫草科，菊科的千里光族、泽兰族，以及豆科的猪屎豆属，此外在夹竹桃科、兰科、百合科、玄参科、旋花科、禾本科、唇形科等部分植物中也含有此类生物碱[2]。

PAs是一种复合分子，在结构上一般由次碱（如千里光次碱，necine）和次酸（如千里光次酸，necic acid）2个基本部分组成[3]。千里光次碱的吡咯环结构为PA的母核，由2个稠合的含氮的五元环状结构组成，该部分可被杂酸酯化形成单酯、开链双酯或大环双酯[4]。当千里光次碱中N被氧化，可形成相应PANOs，与PAs同时存在于植物体内[5～6]。根据千里光次碱在1、2位碳原子上形成的键型结构的不同，可将PAs分为饱和型PAs和不饱和型PAs两大类，其中饱和型PAs无明显毒性，而不饱和型PAs易被细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A氧化，经肝脏代谢形成烯丙醇酯结构的吡咯代谢物。吡咯代谢物易与组织中各种亲核性的酶、蛋白质、DNA、RNA结合，引起肝细胞代谢紊乱、脂肪变性和坏死性损伤，对人类和动物有毒害作用[5，7]。

PAs因其毒性已成为国际社会上关注的新热点，国内外已有众多学者对PAs的毒性和危害作了深入研究。当人体摄入大量PAs后，会造成急性和慢性肝损害，据报道，山岗橐吾碱（clivorine，PAs的一种）对肝脏具有直接毒害作用，引起肝脏静脉闭塞性疾病[8]。YANG等[9]通过比较实验证实了活性吡咯中间体在诱导肝毒过程中的关键作用。最新研究发现，PAs摄入过多会引起肺动脉高压、心脏肥大和肾脏退行性损伤[10]。PAs的吡咯代谢物还能破坏DNA结构或形成DNA交联和DNA蛋白复合物，进而诱导基因突变乃至癌变[11]，另外PAs在发育毒性[12]等方面也有相关报道。KOLREP等[13]和MOREIRA等[14]研究表明，脱氢的PAs和PAs的氮氧化物对人体有直接毒害作用，严重时可导致死亡。

PAs和其相应的PANOs威胁人类健康的主要原因是植物源污染，当人体直接摄入含有PAs及其PANOs的植物源食物（野菜、花草茶、中药材）或间接摄入受植物源污染食物（蜂蜜、鸡蛋、牛奶、茶叶、肉类等），都会对人体造成不可逆的伤害。鉴于此，世界上已有多个国家和组织制定了植物源食品中PAs的摄入限量标准[15]。世界卫生组织（WTO）在1989年就颁布了《IPCS健康与安全指南第26号：吡咯里西啶类生物碱的健康和安全指南》，建议PAs日摄入量不超过15μg/kg[16]；英国毒性研究委员会（COT）和德国联邦风险评估研究所（BfR）建议每日摄入量不超过0.007μg/kg bw[17]；欧洲药物管理局（EMA）限定，PAs的成人日摄入量最高为0.35μg/kg，儿童为0.007μg/kg[18]；欧盟委员会（EU）于2020年12月11日修订了法规（EC）No 1881/2006中某些食品PAs的最高水平，其中，草药浸剂为200μg/kg，草本冲剂、茴香等为400μg/kg，茶和调味茶为150μg/kg，含草药成分的食品补充剂为400μg/kg，花粉及花粉制品为500μg/kg，琉璃苣叶为750μg/kg，小茴香籽为400μg/kg[19]。

为了保护人类健康和安全，植物源样品中PAs及其PANOs的检测分析方法的开发和应用显得尤为重要。本文综述了近年来植物中有毒PAs分析方法的应用，包括不同植物中多种PAs的提取、净化和检测，通过对植物中PAs不同分析方法的对比研究和展望，旨在为制定植物中有毒PAs的限量标准提供分析技术保障，也为从事相关领域的分析人员提供更简单、高效和环保的分析方法，同时为进一步开发植物中多种PAs的检测和分析技术提供一定的研究思路。

一、植物中PAs的提取

根据PAs的结构特征可知，PAs是含有碱性氮的相对极性有机化合物[20]，其作为还原性生物碱，极易被氧化为相应的氮氧化物（PANOs属于极性分子）。对于植物中PAs的提取，提取溶剂通常采用一些具有较强极性的醇溶液（如甲醇、乙醇），或醇与水的混合溶液。PAs在酸性条件下以离子形式存在于水溶液中，在水中加入少量的酸（如硫酸、盐酸、酒石酸、甲酸），可提高PAs的水溶性，提高萃取效率[21]。近年来植物样品中PAs的提取方法有索氏提取、超声辅助提取、超临界流体萃取、加压溶剂萃取、微波萃取。

（一）索氏提取索氏提取（SE），是从植物复杂基质中萃取PAs应用最频繁的经典萃取技术。该方法利用溶剂回流和虹吸原理，通常用于进一步提纯或分离步骤前获得粗植物提取物[22]。HÖSCH等[23]通过改变索氏提取的时间对白叶香茶菜中PAs及PANOs的提取效率进行探究，结果表明，在加热条件下，随着提取时间的延长，PAs的含量逐渐升高而PANOs的含量却逐渐下降，回收率由99.5%降到84.1%。因此，在使用索氏提取法提取植物样品中PANOs时，要注意控温和提取时间。

（二）超声辅助提取超声辅助提取（UAE）是一种基于超声机械波在液体介质中的空化作用、机械效应和热效应等产生并传递强大的能量，加速胞内PAs的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取技术[24]。陈丽华等[25]以95%甲醇水作为提取溶剂在常温下对番泻叶药材进行超声提取30 min，结果表明，14种PAs均有较好的线性关系，回收率为80.60%～103.22%。乔月等[26]利用超声辅助提取法在室温下对款冬花中PAs和PANOs提取30 min，平均回收率在71.52%～105.96%，RSD＜5.7%，方法的回收率良好。ZHOU等[27]利用0.05 mol/L盐酸超声提取千里光属植物中7种PAs，回收率在91.4%～110.8%。

（三）超临界流体萃取由于超临界流体萃取（SFE）中的萃取剂是介于气液之间的一种既非气态又非液态的物态，该特性引起研究者的关注[28]。BICCHI等[29]利用离线超临界流体萃取及毛细管气相色谱法测定了窄叶黄菀和心形菜蕨中PAs的含量，该方法的回收率为90%～105%，回收率满足要求。

（四）加压溶剂萃取加压溶剂萃取（PSE）是一种采用常规溶剂，在较高的温度（50～200℃）和压力（10.3～20.6 MPa）下对植物源样品中PAs进行萃取的样品前处理技术，它与SFE有一些共同原理[30]。KOPP等[22]利用加压溶剂萃取法在50～125℃和10 MPa下对夏枯草、款冬和铁皮石斛中PAs和PANOs进行提取，结果表明，在50℃，提取溶剂为5%甲酸的条件下，夏枯草的回收率最高，达到174.4%；在125℃，提取溶剂为1%甲酸的条件下，款冬的回收率最高，达到156.5%；在50℃，提取溶剂为5%硫酸的条件下，铁皮石斛的回收率最高，达到288.7%。

（五）微波萃取微波萃取又称微波辅助提取（MAE），是指使用适当的溶剂在微波反应器中从植物、矿物、动物等组织中提取各种化学成分的技术和方法[31]。林丽清等[32]采用微波萃取法对鬼针草中总生物碱进行提取，选择95%乙醇为提取溶剂，微波功率为40 W，提取30 min，回收率可达100.4%，RSD为0.889%，优化后的方法回收率较高，精密度较好。

索氏提取固态植物样品可多次与新鲜的提取溶剂接触，提高了PAs的浸取速率，但索氏提取法萃取时间较长，溶剂消耗量大。超临界流体的密度较大，增大了其对PAs的溶解性，但超临界流体萃取过程比较复杂，仪器设备要求较高。加压溶剂萃取的高压条件改善了提取溶剂通过基体的通道，高温降低了提取溶剂的黏度，从而在更短的时间内获得更好的萃取性能，但仪器设备昂贵，操作过于复杂。微波萃取操作简单方便，溶剂消耗量较少，提取效率高，但每次可制备的样品较少，对于植物中PAs的提取具有选择性，适用范围小。超声辅助提取法与以上几种提取方法相比，具有操作简单、仪器设备成本低、适用范围广、溶剂消耗量少及提取效率高等优点，已成为不同植物样品中快速提取多种PAs的有效方法。

二、植物中PAs的净化

由于植物基质提取液的成分比较复杂，往往需要对其进行净化处理。近年来关于PAs从植物基质中净化的方法主要有3种。

（一）液液萃取液液萃取（LLE）是一种基于相似相溶原理，根据PAs在液相之间的溶解度差异进行分离的传统分离净化方法。梁威等[33]采用液液萃取法分离纯化广西产千里光药材中的阿多尼弗林碱（adonifoline），平均回收率为98.9%，RSD为0.70%。由于该方法操作过程比较烦琐，不能同时分离纯化植物基质中的PAs及其氮氧化物，不能满足现代分析技术对PAs进行痕量分析的要求，因而渐渐被固相萃取法、分散固相萃取法所取代[21，34]。

（二）固相萃取固相萃取（SPE）是基于吸附剂与分析物本身之间的相互作用将分析物吸附到固体吸附剂上，因此选择合适的吸附剂非常重要[35]。常用的SPE柱有C8、C18、SCX，其中SCX的使用可以有效地去除弱极性与离子型极性干扰物质，同时满足PAs和PANOs的回收率要 求[34，36]。JI等[37]利用固相萃取法对平卧菊三七中11种PAs进行分离纯化，分别比较了PCX、SCX和C183种SPE小柱的净化效果，结果表明，PCX柱的净化效果最佳，平卧菊三七基质中9种PAs的回收率为84.0%～99.4%。张兰等[38]采用0.1%甲酸水溶液和SCX固相萃取柱对花茶中5种PAs进行提取和净化，得到的回收率为89.69%～102.12%，RSD为0.3%～5.4%。

（三）分散固相萃取分散固相萃取（dSPE）是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。近年新发展起来的基质分散固相萃取法（QuEChERS法）是一种快速、高效、简便、安全、绿色环保及价格低廉的前处理方法[39～40]，其渐渐被用于植物复杂基质中PAs的分离纯化。ZBYNEK等[41]采用分散固相萃取法对高粱、牛至和花草茶中33种PAs进行提取净化，得到高粱中33种PAs的回收率为82%～115%，牛至中为80%～106%，花草茶中为78%～117%，RSD均在19%以下。PIOTR和BOZENA[42]采用超声辅助改良QuEChERS方法提取和纯化薄荷、甘菊、荨麻和椴树中30种PAs，发现添加石墨烯的QuEChERS在超声辅助提取下，4种植物样品中的PAs均获得理想的回收率，范围为60%～128%，RSD＜17%。

液液萃取法作为一种常规技术为之后的固相萃取和分散固相萃取的开发奠定了基础，但由于其时间长、溶剂要求高等缺点，现在已经很少被用于植物中PAs的净化。固相萃取可更有效地将PAs与干扰组分分离，缩短样品预处理过程，在去除杂质的同时，还可实现样品的富集净化，提高PAs的回收率。但与QuEChERS法相比，SPE溶剂消耗量较大，耗时较多，价格较为昂贵，且操作复杂。QuEChERS法操作简单快捷，具有溶剂用量少、提取效率高、纯化效果好的特点。

三、植物中PAs的检测分析

随着科学技术的发展，植物中PAs的检测技术越来越多样化。近年来植物中PAs的检测方法有比色法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附法、色谱法、质谱法、色谱质谱联用法。

（一）比色法

1.酸性染料比色法。酸性染料比色法是在一定的介质条件下，PAs可与氢离子结合生成相应的阳离子，然后用分光光度计在一定波长下测定离子对的吸光度，即可对植物中PAs进行定量。BIRECKA等[43]利用硼酸或醋酸溶液使氯仿中的天芥菜碱（heliotrine）、倒千里光裂碱（retronecine）、仰卧天芥菜定（supinidine）和颈花脒（trachelanthamidine）等PAs离子化，得到的萃取液在525 nm的波长下进行检测，该方法的检出限（LOD）为0.5 mg/L，定量限（LOQ）为2～15 mg/L。

2.Ehrlich反应比色法。Ehrlich反应比色法是利用Ehrlich试剂（4－二甲氨基苯甲醛）与经衍生化PAs的吡咯衍生物进行显色反应生成相应的络合物，该物质在特定波长下有着强烈的光吸收，用分光光度计在该波长下进行测定的方法。梁威等[33]用该方法测定了广西千里光药材中阿多尼弗林碱的含量，Ehrlich试剂与衍生物发生显色反应，生成酒红色的物质，回收率为98.9%，检出限为1.02 mg/L，RSD为0.70%。

（二）毛细管电泳法毛细管电泳法（CE）是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据植物样品中各组分间淌度和分配行为上的差异而实现PAs分离和测定的方法。YU等[44]用动态pH连接扫描毛细管电泳法测定了中草药款冬中4种有毒的PAs，结果表明，PAs敏感度增强23.8～90.0倍，检出限可达0.03 mg/L，该方法还同时检测了样品基质类型、pH和盐浓度等关键因素。

（三）酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ELISA）是利用PAs与酶标记抗体间特异性的免疫反应以实现对植物中PAs进行定性定量检测的免疫学技术。BOBER等[45]用竞争性酶联免疫吸附法测定了倒千里光裂碱和野百合碱（monocrotaline），该方法对倒千里光裂碱有更好的竞争性，其在490 nm下读数成线性关系，相关系数为0.99，检出限为0.2 mg/L。

（四）色谱法

1.薄层色谱法。薄层色谱法（TLC）是根据比移值（Rf）与适宜的对照物所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，用以测定植物样品中PAs含量的方法。TOMASZ等[46]以薄层扫描结合离子对高效液相色谱的方法，同时测定了聚合草、款冬等6种植物中倒千里光碱（retrorsine）、倒千里光碱氮氧化物（retrorsine-N-oxide）、克 氏千里光碱（senkirkine）、千里光菲灵碱（seneciphylline）和千里光宁碱（senecionine）的含量。该方法在220 nm波长下扫描，方法的检出限为0.06～0.10 mg/L，定量限为0.20～0.35 mg/L，RSD为1%～3%。

2.超临界流体色谱法。超临界流体色谱法（SFC）是以超临界流体（如二氧化碳等）作为流动相结合特定的检测器对植物中PAs进行检测的一种色谱方法。HOLZER等[47]采用毛细管超临界流体色谱法检测了千里光植物中8种PAs，该方法分离效果好，灵敏度高，检出限可达1.0 mg/L。

3.气相色谱法。气相色谱法（GC）是利用载气作流动相实现对植物样品中PAs分离测定的分析方法。NICHOLAS等[48]利用GC－NPD法测定了聚合草中西门肺草碱（symphytine）和蓝蓟定（echimidine）的含量，对于西门肺草碱，其检出限为0.1 mg/L，蓝蓟定的为0.1～0.4 mg/L，线性相关系数为0.99。

4.液相色谱法。液相色谱法（LC）是用液体作为流动相来实现对植物样品中PAs分离测定的方法。宁娱等[49]通过高效液相色谱串联二极管阵列检测器（HPLC－DAD），采用Kromasil RP－C18色谱柱，以乙腈和水（0.1%磷酸+0.4%三乙胺）为流动相，在220 nm波长下对一点红中的克氏千里光碱的含量进行检测，结果表明，克氏千里光碱的含量为0.15～0.81 mg/L，平均含量为0.40 mg/L。

（五）质谱法质谱法（MS）是在电场和磁场双重作用下将PAs打成碎片离子，根据分离后不同特征碎片离子的质荷比对PAs进行检测分析的方法。CHEN等[50]采用实时质谱法（DART－MS）快速鉴别和测定了菊三七中6种具有代表性的PAs，该法在正离子模式下扫描，质荷比设置为150～1 000，得到了方法的检出限为0.55～0.85 μg/L，定量限为1.83～2.82μg/L，RSD＜10%。此外，DART－MS的检测结果与HPLC－MS的检测结果基本一致，证实了该方法的准确性。

（六）色谱质谱联用法

1.气相色谱与质谱联用法。气相色谱与质谱联用法（GC－MS）已越来越多运用于PAs的检测分析中。MICHAEL等[51]通过GC－MS测定了臭狗舌草、蓝蓟和蝴蝶兰花粉中1，2－不饱和PAs及其PANOs，该法在SIM模式下进行测定，结果计算为单一倒千里光裂碱当量，检出限为0.003 mg/L，定量限为0.01 mg/L。

2.液相色谱与质谱联用法。液相色谱与质谱联用法（LC－MS/MS）是在单一液相色谱法检测器不能对PAs达到很好的检测灵敏度的背景下提出的。液质联用仪采用的离子源常为大气压化学电离离子源（APCI）或电喷雾离子源（ESI），后者应用比较广泛，常用于极性较强的PAs和PANOs的痕量分析。APCI在流动相pH为9～10时，其电离的灵敏度急剧增加，对游离PAs分析有良好的稳定性，但其对极性的PANOs的灵敏度较低，不适用于PANOs的痕量分析[20]。乔月等[26]采用UPLC－MS/MS法同时测定了款冬花中15种PAs及其PANOs。该方法的离子源采用电喷雾正离子模式，根据PAs和PANOs的碎片化路径，在MRM模式下筛选出PAs和PANOs的前体离子，方法的检出限为0.010 8～0.218 0μg/L，定量限为0.089 7～0.592 1μg/L，RSD为2.8%～9.0%，生物碱的回收率在68.10%～105.96%。

上述LC－MS/MS研究中多使用目标MS/MS设置，对于检测无对照标准品的PAs及其PANOs具有很大的局限性和不确定性。为解决上述问题，研究者进一步开发了液相色谱与高分辨质谱联用技术（LC－HRMS），使用高分辨质谱可以全面获取样品中未知PAs的精确相对分子质量和碎片离子信息，实现对未知PAs的结构及PAs的同分异构体筛选鉴定和痕量分析[52]。ALEXANDER等[53]采用UPLC－ESI－TOF－MS对绿穗苋提取物中的5种PAs进行定性定量分析，采用电喷雾正离子源模式，质谱采集范围为50～600 Da，使用0.5 ng/mL亮氨酸脑啡肽溶液进行实时质量校正，所得PAs的定量限为2μg/L。JEONG和LIM[54]使用UPLCESI－Q－TOF－MS法快速准确测定了琉璃苣、款冬、紫草、聚合草中9种PAs，该法在电喷雾正离子源模式下，扫描时间设置为0.25 s，以获取m/z在50～1200的数据，可准确提供PAs前体和碎片离子质量信息并能够同时完成对其定量分析，检出限为0.4～2.0μg/L，定量限为0.6～6.0μg/L。此外，还表征了70种PAs及PANOs的前体离子及其生成的特征碎片离子，对于未知PAs的鉴定和痕量分析提供了参考数据。

比色法、CE、TLC和SFC是早期研究者常使用的方法，对于浓度较低的植物材料来说，往往不能准确完成定量。ELISA和MS的灵敏度高，极大地缩短了检测时间，能完成定性和定量分析。但ELISA试剂盒昂贵，有时也会有假阳性出现，MS单独使用效率较低。GC、GC－MS和LC可以对复杂植物基质多种PAs完成分离和测定，但GC和GC－MS不适用于PANOs的分析，且衍生化烦琐、耗时，可能发生生物碱的双酯化；LC的紫外最大吸收波长常超出检测器的范围，使检测灵敏度大大降低。为解决上述问题，研究者在目标MS/MS设置的基础上开发了LC－HRMS，利用HRMS不仅可实现对不同结构的PAs和PANOs进行定性定量分析，还可准确提供未知PAs前体和碎片离子质量信息并能够同时对其痕量分析，其检测范围广，分析时间短，具有高灵敏度和更低的检出限，能达到WTO、COT、BfR和EU等权威组织和机构制定的限量标准。

四、展望

随着科学技术的不断进步，植物样品中PAs的检测分析技术也在不断地发展和完善。高灵敏度和高选择性的液相色谱与高分辨质谱联用技术开发成为今后PAs检测技术的主要发展方向。对于不同的植物样品和不同结构类型PAs及PANOs，在分析时应充分考虑样品的特点，包括植物的分类（科、属、种）和生长期。不同种类植物的特征有较大差异，如形态特征、颜色、水分含量等都会对提取和净化有不同的要求，木质化的植物前处理较为麻烦，需要进行预处理（粉碎、研磨等）；细胞色素含量较高的植物还需净化去除色素；水分含量较大的植物需要烘干后再进行前处理。同种植物在不同生长期，其形态结构和水分含量也有较大差异，在分析测定时应根据各生长期的特点选择合适的前处理方法。

目前，研究者多采用超声辅助QuEChERS方法提取净化植物样品中的PAs，并根据不同研究对象和生物碱的特点，对超声（超声时长、频率、温度等）和QuEChERS条件（吸附剂的组合、用量等）进行优化，形成高效可选择性的前处理方法。改良超声辅助分散固相萃取结合超高效液相色谱与高分辨质谱联用法的应用，可为植物源样品中多种PAs分离和定性定量检测提供技术支持，为进一步完善PAs在农产品中限量标准的制定和毒理评价方面的研究提供技术指导，为进一步消除PAs污染农产品隐患、加强农产品质量安全提供技术保障。