甘草及姜根提取物复配乳液舒缓功效研究

薛文斌 卢正君 董长青

目的：研究甘草酸二钾和姜黄素复配乳液的舒缓功效。

方法：MTT法检测复配乳液对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性;选择无毒性浓度构建LPS刺激模型，酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中炎症因子TNF-α的含量。初步人体实验随机选取6名敏感皮肤志愿者，脸部使用复配乳液4周，4周后检测水分含量、经皮水分流失的变化并拍照观察。

结果：复配乳液a及b在0.556毫克/毫升浓度范围内对细胞无毒性;RAW264.7细胞在给予LPS 刺激后，TNF-α含量显著升高（P<0.01）;复配乳液a 在0.55毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升浓度下能显著抑制LPS 诱导下TNF-α 的生成（P<0.01和P<0.05）;复配乳液b 在0.185 毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升浓度下能显著抑制LPS 诱导下TNF-α的生成（P<0.05和P<0.01）。初步人体实验显示，使用复配乳液a、b4周后，脸部水分含量显著增加（P<0.01），经皮水分流失显著减少（P<0.01）。

结论：甘草酸二钾和姜黄素复配乳液a及b可抑制TNF-α的生成，具有一定舒缓功效。

舒缓，一般是指能够缓解皮肤泛红、发热、刺痛等现象的能力。这些问题通常由外界刺激引起，一般都会伴有炎症的产生。近年来，开发具有舒缓功效的化妆品成为各化妆品公司的研究热点，化妆品原料中纯天然植物提取物又以其安全无毒、温和无刺激及较强的舒缓能力而备受青睐。甘草是一种传统的舒缓草本植物，甘草具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和免疫调节特性。甘草次酸和甘草酸是从甘草中分离得到的特殊化合物。甘草酸二钾是甘草酸二钾盐，是一种应用广泛的抗炎剂。Lee等发现甘草酸二钾具有改善特应性皮炎的作用。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种多酚类化合物，具有良好的抗炎特性，研究发现姜黄素能显著抑制巨噬细胞炎症因子含量及其基因表达。脂多糖（lipopolysaccharide） 是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是临床革兰阴性细菌引发败血症的主要原因。脂多糖活化的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型，被广泛用于研究炎症反应。巨噬细胞在脂多糖的刺激下，可诱导TNF-α、IL-1等多种炎症因子迅速合成与释放。本研究将甘草酸二钾和姜黄素进行复配，配合水、油脂、乳化剂、流变调节剂等制备成两种化妆品乳液，通过构建LPS 诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型及初步人体实验来评价两种复配乳液的舒缓功效。

Part 1实验材料

1.1 细胞株与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.7购自广东博溪生物科技有限公司;DMEM 高糖培养基、胎牛血清、青霉素链霉素双抗、胰蛋白酶购自Gibco;台盼蓝购自Thermo;LPS购自Sigma;MTT 购自Biosharp;二甲基亚砜（DMSO）购自Admas-Beta;小鼠TNF-α ELISA 检测试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司;甘草酸二钾购自甘肃泛植制药有限公司;姜黄素购自韩国NFC;乳化剂甘油硬脂酸酯柠购自Symrise;EMT-10 购自SEPPIC S.A;PEG-10 聚二甲基硅氧烷购自Shin-Etsu Silicones （Thailand） Limited;二硬脂二甲铵锂蒙脱石购自海名斯英国有限公司。

1.2 受试样品

甘草酸二钾、姜黄素复配乳液由本公司内部复配，辅以水、油脂、乳化剂、流变调节剂等復配成乳液a及乳液b两种乳液。配方详见表1。

1.3 仪器设备

CO培养箱（上海博迅，BC-J160）;生物安全柜（上海尚道，BHC-1300IIA2）; 酶标仪（TECAN，InfiniteF50）;离心机（湖南湘仪，H1850R）;细胞计数仪（Thermo，Countess Ⅲ）; 倒置显微镜（奥林巴斯，CKX53）;水浴锅（ 江阴市保利科研器械有限公司，BHS-4）;Cutometer® dual MPA 580（德国Courage+khazaka）;便携式经皮水分流失仪（Delfin）;Antera 3D（Delfin）。

Part 2 实验方法

2.1 样品处理

细胞实验：复配乳液a 和复配乳液b 分别称取0.5克，用蒸馏水定容到总体积为5 毫升，制成浓度为100 毫克/毫升的水溶液。给药时将此水溶液200微升加入到3.8毫升高糖DMEM（含10% 胎牛血清）中，20微米过滤膜过滤除菌，制成含复配乳液浓度为5毫克/毫升的培养基溶液，再以3倍稀释，分别制成含复配乳液浓度为1.667毫克/ 毫升、0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升、0.021毫克/毫升的培养基溶液。以上样品现配现用。初步人体实验直接将复配乳液涂抹于脸部。

2.2 细胞培养及传代

小鼠巨噬细胞RAW264.7 以每瓶8.0×106个细胞接种于T75培养瓶中、高糖DMEM（含10% 胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗）、37摄氏度，5% CO培养箱培养，

每天换液。待细胞融合率为80% ～ 90% 时进行传代，用细胞刮刀将细胞刮下，离心吹打混匀传代培养，以每瓶8.0×106 个细胞接种于T75 培养瓶中，2 天传一次代。

2.3 实验分组

细胞毒性检测设置空白对照、阴性对照、样品及阳性对照;LPS 刺激模型检测设置空白对照、阴性对照（NC）、样品及阳性对照（PC）。

2.4 细胞毒性检测

小鼠巨噬细胞RAW264.7培养后，用细胞刮刀将细胞刮下，离心吹打混匀，计数，按每100微升/ 孔含3.0×104个细胞铺于96 孔板中，37 摄氏度，5% CO培养箱培养24小时。24小时后小心吸弃每孔培养基，加入不同浓度的待测物，每个浓度3 个复孔，继续放入37 摄氏度，5%CO培养箱培养20小时。20小时后每孔加入5毫克/ 毫升的MTT 溶液，继续放入37℃，5% CO培养箱培养4小时。4小时后小心吸弃每孔上清，加入150微升/ 孔的DMSO吹打至充分混匀，室温避光放置30 分钟。用枪将细胞悬液再次吸打混匀，在酶联免疫检测仪OD492 纳米处测量各孔的吸光值（OD值）。

2.5 细胞毒性计算 ）

细胞相对活率（%）=（样本OD-空白OD）/（ 阴性对照OD-空白OD）×100%

2.6 脂多糖（LPS）刺激RAW264.7炎症模型检测

小鼠巨噬细胞RAW264.7培养后，用细胞刮刀将细胞刮下，离心吹打混匀，计数，按每100微升/孔含3.0×104个细胞铺于96孔板中，37摄氏度，5% CO培养箱培养24小时。24小时后小心吸弃培养基，按照MTT 毒性结果，加入含复配乳液安全浓度的培养基溶液，37摄氏度，5% CO培养箱预处理2小时。空白对照、阴性对照加入正常培养基;阳性对照加入100微克/ 毫升的地塞米松，同样37 摄氏度，5% CO2培养箱预处理2小时。2小时预处理结束后，除空白对照孔外，每孔加入终浓度为10微克/毫升的LPS进行刺激，37摄氏度，5% CO培养箱继续培养24 小时。24小时孵育培养结束后，每孔收集200微升细胞培养上清液于1.5毫升无菌离心管中，置于-80摄氏度超低温冰箱冷冻保存备用。按照ELISA 检测试剂盒说明进行TNF-α含量检测。

2.7初步人体实验

随机选取6 名敏感皮肤志愿者，脸部使用复配乳液四周，检测6 名志愿者使用前及使用4 周后脸部水分含量、经皮水分流失的变化，并进行拍照观察。

2.8统计分析

所有实验数据以x±s表示，应用SPSS 21.0进行统计分析，采用t 检验分析方法，以P<0.05为显著性差异的标准。

Part 3实验结果

3.1 复配乳液对小鼠巨噬细胞RAW264.7 毒性检测MTT 结果显示，以相对活率90% 以上为无毒性标准，复配乳液a 和复配乳液b 在0.556 毫克/ 毫升浓度及此浓度以下对小鼠巨噬细胞RAW264.7 均无毒性，可选取为LPS 刺激炎症模型的实验浓度，具体见表2，细胞相对活率如图1所示。

3.2 复配乳液对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生TNF-α的影响

根据毒性测试结果，选择复配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/毫升、0.062毫克/ 毫升）及b（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）3个无毒性浓度分别进行实验，结果显示小鼠巨噬细胞RAW264.7在LPS 的诱导下TNF-α含量显著上升（P<0.01）;复配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升）能显著抑制LPS诱导下TNF-α的生成（P<0.01 和P<0.05）;复配乳液b（0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）能显著抑制LPS诱导下TNF-α的生成（P<0.05 和P<0.01）;同浓度复配乳液a 和b相比，0.556毫克/ 毫升、0.185毫克/毫升无显著差异，0.062毫克/ 毫升具有極显著差异（P<0.01）。具体见表3，TNF-α含量趋势如图2所示。

3.3 初步人体实验结果

结果显示在使用复配乳液a、b4周后，与不使用产品的脸部对比水分含量显著增加（P<0.01）;经皮水分流失显著下降（P<0.01）;脸部拍照显示血红素含量显著下降。具体见表4，如图3 所示，脸部拍照结果如图4所示。

Part 4结论

近年来，化妆品舒缓功效的研究越来越得到人们的重视，舒缓原料是舒缓功效的核心，而原料不能直接作用于人体，将原料进行复配，制成化妆水、乳或霜是通用的方法，但当多种原料及辅料共同混合后，原料含量降低，且原料之间可能存在互相影响，舒缓原料是否能发挥其原来的舒缓功效需要进行验证。

本研究通过构建LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型结合初步人体实验来评价甘草酸二钾、姜黄素复配乳液a、b的舒缓功效。实验结果显示，复配乳液a、b均能够显著抑制炎症因子TNF-α的生成。初步人体实验结果亦显示其作用于人体皮肤具有一定的舒缓功效。

作者介绍：

薛文斌、卢正君、董长青：上海宜侬生物科技有限公司研发中心