不良孕产史孕妇FMR1基因 CGG重复次数分布特征

赵绍杰 钱芳波 马凤英 鲁静洁 杭 晨 王晓临 孙 慧

南京医科大学附属无锡妇幼保健院(214000)

女性自然停经年龄平均在50.7岁[1]。但40岁前出现月经紊乱、生殖系统萎缩等，临床称为卵巢早衰(POF)或卵巢功能不全(POI)[2]， POF病因复杂，4%～30%具有遗传倾向[3]。随着人们对脆性X 综合征(FXS)深入研究发现，脆性X智力低下1基因(FMR1)与女性卵巢功能紊乱密切相关，在前突变范围内的CGG重复与原发性卵巢功能不全相关[4-6]。除了FMR1 基因前突变与POF具有相关性外，中间或灰色区域的等位基因与POF的发生发展中也有一定关联，可增加POF和早期更年期风险[7-9]。FMR1基因的CGG序列的重复数对卵巢功能损伤程度有重要预测意义，可一定程度上作为预测卵巢储备功能指标之一。从此角度看，FMR1基因CGG重复数与不良孕产史关系值得研究。本研究通过探究不良孕产史育龄女性FMR1基因CGG重复数分布特征，为女性再次妊娠提供咨询指导。

1 资料和方法

1.1 基本资料

选取2018年8月-2020年10月就诊于本院的孕产妇为研究对象，年龄18～47岁。根据研究对象是否有异常生育史分组，不良孕史组有不良孕产史孕妇，即自然流产史≥2次，稽留流产史≥2次，有早产史、胎停育史、死胎史、死产史，生育严重出生缺陷患儿史，出生28天内新生儿死亡史；对照组没有任何内外科合并症且自身免疫性疾病，无不良孕产史孕妇。排除标准：①内外科合并症和腹腔手术史；②患有自身免疫性疾病；③患有内分泌疾病。孕妇均签署知情同意书。本研究经院伦理委员会审批。

1.2 检测方法

1.2.1全血基因组DNA提取收集孕妇外周静脉血2ml抗凝，通过全血磁珠 DNA提取法提取基因组DNA：天隆NP968核酸提取仪结合天隆核酸提取试剂行DNA提取。提取的核酸用Nanodrop2000逐次定量并记录每个样本的相关数据。对DNA浓度较高者稀释以满足实验需求。

1.2.2PCR扩增提取的DNA样本，利用脆性X-FMR1基因AmplideX检测技术(Asuragen，美国)进行CGG重复序列数检测。反应体系为三引物(FMR1上、下游引物、上游CGG引物)进行PCR扩增：向96孔PCR检测板内加入2μl 20ng/μl DNA模板，充分混匀、密封，再次涡旋、离心。使用ABI7500扩增仪进行PCR扩增，条件为：98℃热变形5min，25个循环(97℃ 35s，62℃ 35s，72℃ 4min)，72℃延伸10min。将PCR产物避光保存(-15℃～-30℃)。

1.2.3毛细管电泳使用ABI的3730XL毛细管电泳仪运行Run 3730 Date collection软件测序，应用Gene Mapper分析结果。观察FMR1基因CGG重复次数处于正常范围的高线(n=35～44次)、灰区(n=45～54次)、前突变(n=55～200)、全突变(n>200次)各等位基因频率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象分组及年龄

共纳入325例女性，其中不良孕史组108例，年龄30.6±5.3岁，年龄≥35岁15例、<35岁92例。对照组217例，年龄29.8±4.5岁，≥35岁49例，<35岁168例。两组年龄无差异(P>0.05)。

2.2 CGG重复序列分布

本次研究中FMR1基因检测显示，CGG重复次数的变异范围为n=24～58，其中FMR1基因CGG重复等位基因杂合子数225例，占总数的69.2%，最常见的杂合子为30/29，占总等位基因中的11.4%；最大频率等位基因(CGG)n=30为97例(30.1%)，其次为37、31、29、36各占总的等位基因的19.6%，16.6%，16.3%，3.3%。

2.3 两组FMR1基因(CGG)n重复序列分布

对照组中CGG重复数目的变异范围为n=28～47，FMR1等位基因杂合子有173例，占总等位基因的79.7%，最常见杂合子30/29占总数9.7%。共检测到17种不同的等位基因，最大频率等位基因(CGG)n=30,其次依次为29，31，37，36。不良孕史组中CGG重复数目的变异范围为n=24～58，FMR1等位基因杂合子有79例，占总等位基因的73.2%，最常见杂合子30/29占总数14.8%。共检测到13种不同的等位基因，最大频率等位基因(CGG)n=30，其次依次为31、29、37、36。两组FMR1基因(CGG)n重复序列分布见表1。

表1 两组孕妇基因(CGG)n重复数分布

2.4 两组FMR1基因(CGG)n重复序列各区分布

对照组FMR1基因(CGG)n重复次数在正常范围(6～34)有166例，占总数的76.5%、正常范围高线50例，占总数23.0%；灰区1例，占总数0.5%，无前突变区及全突变。不良孕史组FMR1基因CGG重复次数在正常范围(6～34)有77例，占总数的71.3%、正常范围高线30例，占总数27.7%；前突变区1例，占总数0.9%，无灰区及全突变。正常范围中对照组较不良孕史组(CGG)n重复数占比略高,正常范围高线中不良孕史组较对照组(CGG)n重复数占比略高，但均无统计学差异(P>0.05)；对照组FMR1基因灰区携带率为0.4%(1:232)高于不良孕史组，不良孕史组前突变携带率为0.9%(1:107)高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

FMR1基因是一个高度保守的基因，在5’端第一个外显子上含有一个三核苷酸重复序列(CGG)，在人群中这个CGG 重复序列数目是可变的，根据美国医学遗传学指南(ACMG)[11]，对CGG不同拷贝数的划分标准为：①当FMR1中CGG拷贝数<45时，FMRP正常表达，表型正常，属于正常型，常见的重复长度为29或30，在有丝分裂及减数分裂过程中保持稳定；②当CGG拷贝数为45～54时为“中间型”(灰区，GZ)；③当CGG拷贝数为55～200时为“前突变”(PM)，属于FMR1基因前突变携带者；④当CGG拷贝数>200时为“全突变”(FM)型。

已有文献报道PM范围内的FMR1基因扩增突变是卵巢反应受损和受精率降低的原因[12-13]。卵巢反应受损和受精率降低会导致不孕、自然流产、胚胎停育等一些不良孕产史。 灰区等位基因以及正常范围高线等位基因(35～44的CGG重复)的扩展结果存在争议。研究显示，FMR1基因CGG重复序列增加，POI的发生率增加，卵巢储备功能降低减少[14-15]。与正常人相比，灰区范围扩展的等位基因与亚生育率、月经不规则、更年期更早、POI、非整倍体率、流产和异卵孪生率的发生有关[16]。但未发现不良孕产史与突变前携带女性间存在正相关[17-18]。这些发现表明FMR1基因可能参与了一系列卵巢功能障碍。

本研究发现最常见的等位基因为(CGG)n=30，其次为37、31、29、36，这与国内一些研究基本相符[19-20]，也与亚洲人种的CGG分布状况基本相似[21-22]。本研究育龄女性中前突变携带率为1/325,与国内外研究显示前突变(n=55～200)的携带率(1:113～1:328)相近。本研究比较了不良孕产史组和对照组FMR1基因(CGG)n重复数分布，结果显示在两组人群中最常见等位基因分布一致，与对照组相比不良孕产组中FMR1基因(CGG)n≥35占比较多,且在不良孕史组中检出1例前突变携带者，携带率为0.9%，显示出FMR1基因在不良孕产史人群中筛查的意义。

随着我国妇女再生育需求增多，评估备孕妇女生殖机能和提高自然受孕率成为重点，卵巢储备功能是评估备孕妇女生育能力的关键。本研究发现，FMR1基因(CGG)n重复序列前突变与孕妇不良孕产史可能存在相关性，对再次妊娠前遗传咨询指导有一定价值。