妊娠期糖尿病患者外周血SREBP-1、PPARα表达与胰岛素抵抗关系

魏晓丹 贾利平 符 琴 王 桂 王咸菊 符永燕

1.海南省屯昌县人民医院(571600)；2.海南医学院第二附属医院

妊娠期糖尿病(GDM)是危害孕妇和胎儿健康的常见妊娠合并症[1-2]。病因及发病机制目前尚未完全明确，但随着研究的深入，胰岛素抵抗被认为是GDM发病重要环节，在不良结局中发挥重要作用[3]。固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)参与机体糖脂代谢，其过度表达可加重2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的胰岛素抵抗过程[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)是脂肪细胞分化、增殖及脂肪酸摄取、储存所必需的因子，其水平升高可改善机体内的胰岛素抵抗[5-6]。基于此，本研究探讨SREBP-1、PPARα在GDM患者外周血中的表达及与胰岛素抵抗关系，为GDM发病机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月-2020年6月在本院妇产科定期产前检查的GDM患者90例(GDM组)，正常妊娠孕妇90例(对照组)。纳入标准：①GDM参照有关诊断标准[7]；②单胎初产；③年龄>18岁，孕前体质指数正常；④产前检查规律、临床资料完整且对本研究知情同意。排除标准：①妊娠前合并高血压、肿瘤、肝肾功能不全、内分泌疾病、心血管病、糖尿病及其他影响糖代谢疾病；②近期曾服用可能干扰糖脂代谢药物；③有吸烟等不良生活嗜好；④胎儿畸形；⑤不配合本研究或中途终止妊娠。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol试剂购自上海杰美基因医药科技有限公司；SYBR定量PCR试剂盒购自美国KAPA Biosystems公司；SREBP-1、PPARα、GAPDH引物由北京百奥莱博科技有限公司合成；一抗SREBP-1抗体、PPARα抗体、GAPDH抗体，HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国abcam公司；ECL发光试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司。Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪购自美国QIAGEN公司；MG8000凝胶成像系统购自美国Thmorgan公司；Cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪购自德国罗氏公司。

1.3 方法

1.3.1标本采集与处理采集孕妇空腹外周静脉血两份，一份放入抗凝管(含抗凝剂)中，即外周血；另一份放入促凝管中，室温下静置30 min，离心分离血清，保存在-80℃中待测。

1.3.2外周血SREBP-1、PPARαmRNA表达水平检测取外周血样本，使用TRIzol试剂提取总RNA，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA，使用SYBR定量PCR试剂盒配制反应体系，在实时荧光定量PCR仪上进行qRT-RCR反应，以GAPDH为内参基因，2-ΔΔCt法计算SREBP-1、PPARα mRNA表达水平。引物序列如下，SREBP-1上游：5'-GATGTGCGAACTGGACACAG-3'，下游：5'-CATAGGGGGCGTCAAACAG-3'；PPARα上游：5'-GGGAAAGACCAGCAACAACC-3'，下游：5'-TGGCAGCAGTGGAAGAATCG-3'；GAPDH上游：5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'，下游：5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'。

1.3.3WesternBlot法检测外周血SREBP-1、PPARα蛋白表达水平取外周血样本，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量，取适量蛋白样品煮沸变性，经电泳、转膜、封闭后，用一抗稀释液(SREBP-1抗体、PPARα抗体、GAPDH抗体，1：500)4℃缓慢摇动孵育过夜，洗涤后，用二抗稀释液(1：2000)室温孵育1 h，用ECL发光试剂盒显色，凝胶成像仪扫描图像，Image J软件分析条带灰度。

1.3.4胰岛素抵抗指标取血清样本，全自动电化学发光免疫分析仪检测空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)水平，按照稳态模型评定法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料

GDM组年龄(28.7±4.9)岁(23～36岁)；孕周(35.9±3.6)周(32～38周)；对照组年龄(29.0±5.2)岁(23～36岁)，孕周(36.2±4.2)周(33～39周)。两组年龄、孕周无差异(P>0.05)。

2.2 外周血SREBP-1、PPARα mRNA表达

GDM组外周血SREBP-1 mRNA表达水平(1.84±0.23)高于对照组(1.00±0.00)，PPARα mRNA(0.52±0.08)低于对组组(1.00±0.00)(t=34.648、56.921，均P=0.000)。

2.3 外周血SREBP-1、PPARα蛋白表达水平

GDM组外周血SREBP-1蛋白表达水平(0.88±0.08)高于对照组(0.43±0.06)，PPARα蛋白表达水平(0.34±0.04)低于对照组(0.68±0.06)(t=42.691、44.730，均P=0.000)。见图1。

图1 两组外周血SREBP-1、PPARα蛋白检测

2.4 血清FINS、FPG、HOMA-IR水平

GDM组血清FINS、FPG、HOMA-IR水平均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清指标比较

2.5 GDM孕妇外周血SREBP-1 mRNA和蛋白水平与HOMA-IR相关性

GDM孕妇外周血SREBP-1 mRNA、SREBP-1蛋白水平与HOMA-IR水平均呈显著正相关(r=0.465、0.587，均P<0.05)。见图2。

图2 GDM孕妇外周血SREBP-1 mRNA和蛋白水平与HOMA-IR相关性

2.6 GDM孕妇外周血PPARα mRNA、PPARα蛋白水平与HOMA-IR水平的相关性

GDM孕妇外周血PPARα mRNA、PPARα蛋白水平与HOMA-IR水平均呈显著负相关(r=-0.523、-0.537，均P<0.05)，见图3。

图3 GDM孕妇外周血PPARα mRNA、PPARα蛋白水平与HOMA-IR相关性

3 讨论

糖尿病由多种病因引起胰岛功能紊乱[8]。与胰岛素绝对缺乏的1型糖尿病相比，胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病的发生发展过程[9]。而当代偿性分泌的胰岛素不足以调节血糖时，机体血糖升高最终发生糖尿病[10]。因此，改善胰岛素抵抗是预防治疗2型糖尿病的关键。GDM的发病原因与胰岛素抵抗有关[11]。许多学者认为，在妊娠中胰岛素酶、雌激素、孕酮等对胰岛素活性有抵抗作用的激素水平大幅度升高，导致胰岛素敏感性降低，使孕妇出现生理性的胰岛素抵抗，机体补偿性上调胰岛素水平，当分泌的胰岛素仍不足以调节血糖正常时导致孕妇糖耐量异常发生GDM[12]。本研究结果，GDM孕妇的FINS、FPG、HOMA-IR水平较正常妊娠孕妇升高，提示GDM者FINS、FPG、HOMA-IR存在异常，且可能发生胰岛素抵抗。因此，探讨影响GDM患者发生胰岛素抵抗的因素并改善，对预防GDM意义重要。

SREBP-1参与脂质代谢的调控[13]。机体胰岛素敏感性下降时，血液中胰高血糖素升高，脂肪分解并释放大量游离脂肪酸富集在胰岛素靶器官，导致器官胰岛素敏感性降低[14]。张哲滔等[6]研究显示，菖蒲郁金汤化裁方治疗2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠，可减少肝脏脂肪沉积及细胞变性，并改善胰岛素抵抗，其作用机制可能与降低SREBP-1表达有关。本研究与正常妊娠孕妇相比，GDM孕妇外周血SREBP-1 mRNA及蛋白表达水平均升高，且表达水平与HOMA-IR水平均呈正相关，提示GDM孕妇体内SREBP-1表达异常，其可能参与了GDM发病调控，表达水平升高可能与GDM患者发生胰岛素抵抗有关，但作用机制有待探究。

PPARα被脂肪酸配体活化后能调节脂质摄取、储存，并促进脂肪酸氧化[15]。尹清晟等[16]研究显示，金芪降糖片联合胰岛素能改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性，其机制可能与激活PPAR-α/FGF21信号有关。王超等[17]研究显示，氧化苦参碱平衡胰岛素抵抗小鼠体内的肝脂代谢并改善胰岛素抵抗的作用机制与其上调CPT1、PPARα表达和下调LPL、FAT/CD36有关。本研究与正常妊娠孕妇相比，GDM孕妇外周血PPARα mRNA及蛋白表达均降低，提示PPARα参与了GDM的发病过程；GDM孕妇外周血PPARα mRNA及蛋白表达水平与HOMA-IR水平均呈负相关，提示GDM孕妇体内PPARα表达降低可能与GDM发病及胰岛素抵抗水平升高有关，推测这种异常可能破坏脂质代谢平衡，导致更多脂质堆积引起胰岛素抵抗。

综上所述，GDM孕妇外周血中SREBP-1 mRNA及蛋白表达水平升高，PPARα mRNA及蛋白表达水平降低，均与患者体内胰岛素抵抗水平升高有关，针对两者表达水平展开治疗可能对临床改善GDM孕妇胰岛素抵抗水平有一定帮助。