苹果糖转运蛋白基因家族筛选鉴定

◎ 阚东扬，冉秋月，唐玉凤，杨润森

（1.昭通学院 农学与生命科学学院，云南 昭通 657000；2.滇东北高原特色农业研究中心，云南 昭通 657000）

可溶性糖积累由合成、降解、转运以及贮存等过程共同决定，而较为关键的是转运环节[1]，研究糖相关转运蛋白对完善果实糖品质性状遗传与发育机理具有重要意义[2]，而且糖转运蛋白在植物应对逆境胁迫方面也起着重要作用。拟南芥作为一种模式植物，在糖转运蛋白方面的研究已比较成熟，目前从拟南芥中分离出69种相关的糖转运蛋白（SWEET）。SWEET基因家族是一类植物己糖和蔗糖转运蛋白，包含4个亚 家 族[3]，Clade I包 括SWEET1-SWEET3，Clade II包 括SWEET4-SWEET8，Clade III包 括SWEET9-SWEET15，Clade IV包 括SWEET16-SWEET17[4]，目前对于SWEET基因家族的研究较少。拟南芥中的糖转运蛋白不仅能够参与ABA诱导的糖代谢途径[5]，而且可受低温、盐胁迫等的诱导参与逆境胁迫与糖信号代谢[6]。糖转运蛋白在植物碳水化合物的长距离运输中起重要作用，并参与植物的生长发育、能量运输与调节，与经济作物苹果的产量和品质直接相关[7]。

我国是苹果生产大国，苹果产量约占世界产量的一半，其中昭通苹果以富含多种果糖以及微量元素而驰名国内。昭通苹果产区与全国其他苹果产区相比，具有明显的区位优势、早熟优势、生态优势和品质优势，为中国南方高原苹果优质生产基地之一[8]。但昭通地处高寒山区，早春干旱、冬季过暖，并且冰雹和霜害等灾害性天气频繁发生，因此对培育抗逆性强且糖含量高的苹果品种较为迫切。糖含量是决定苹果风味、品质的关键因素之一，而糖分的积累主要是多种糖转运蛋白共同协作的结果，因此，鉴别这些糖转运蛋白对于苹果选育和改善含糖量具有重要意义。本研究通过获取糖转运蛋白序列，进行糖转运蛋白在逆境胁迫中的基因差异表达量分析，筛选抗性强的糖转运蛋白基因，旨在为昭通苹果分子育种和优良品种选育提供参考依据。

1 选定基因家族

选择拟南芥中糖转运蛋白家族的基因，通过NCBI，利用database数据库对其进行聚类分析，如图1。根据聚类分析图，将得到的3种基因型植株的糖转运蛋白表达量数据绘图，如图2。

图1 拟南芥糖转运蛋白基因聚类分析图

图2 3种糖转运蛋白在逆境下表达量差异图

由图2可以看出，在强逆境环境下野生型植株的3种糖转运蛋白基因表达量相较于突变体植株有极显著的提高，在低强度逆境下野生型植株的3种糖转运蛋白基因表达量也明显高于突变体植株，这表明糖转运蛋白与抵御逆境胁迫有明显的正相关关系。

2 苹果糖转运蛋白鉴定分析

2.1 苹果糖转运蛋白基因家族亲缘关系分析

苹果属于蔷薇科植物，糖转运蛋白家族在进化上又具有一定的保守性，因此选取拟南芥、其他蔷薇科植物以及苹果，对它们构建糖转运蛋白基因的进化树，如图3。

通过构建进化树由图3可以看出，可以看到在进化树上，大于72的区间内，苹果和拟南芥的糖转运蛋白：sweet1、sweet4、sweet1和sweet3具有较近的亲缘关系，在基因的进化上具有一定的保守性。

图3 糖转运蛋白基因进化树图

2.2 苹果糖转运蛋白染色体定位

通过对苹果和拟南芥糖转运蛋白基因，sweet4、sweet1进行序列比对，发现苹果的sweet1与拟南芥的sweet4在序列上有70%的相似性，进化树分析也支持苹果和拟南芥的糖转运蛋白基因家族有较近的亲缘关系，利用GDR（http://www.rosaceae.org/）库进行分析，发现在苹果的16号染色体上存在与拟南芥sweet12具有很高相似性的一段序列，对其进行染色体定位，如图4所示。

图4 sweet12在苹果染色体上的定位图

由图4可以看出，该片段在苹果16号染色体上，长度约为2.2 kb，并鉴定出其相应的内含子与外显子。

3 结论与讨论

3.1 糖转运蛋白与抵御逆境胁迫有正相关关系

聚类分析表明，糖转运蛋白家族与抗植物逆境胁迫有明显的正相关关系，研究糖转运蛋白基因在不同时期、不同植物体内的相对表达量变化有助于人们更好地认识植物与环境之间的互动。

3.2 苹果和拟南芥的糖转运蛋白具有较近的亲缘关系

通过构建糖转运蛋白基因进化树，发现苹果和拟南芥的糖转运蛋白家族具有较近的亲缘关系，这为研究苹果糖转运蛋白家族提供了相近的模式植物，为苹果糖转运蛋白家族的研究以及功能鉴定提供了便利。

3.3 SWEEET12可能是参与抵御逆境胁迫的关键酶基因

通过对拟南芥糖转运蛋白家族序列的聚类比对，可以看出AtSWEEET12与抵御逆境胁迫有着明显的正相关关系，说明SWEEET12极有可能是参与抵御逆境胁迫的关键酶基因。已有研究证明，苹果糖转运蛋白基因与拟南芥AtSWEET成员蛋白在同一个进化枝上，参与糖代谢相关转运功能[9]，MdSWEET12基因染色体定位预测结果也证实SWEET12基因在苹果16号染色体上。利用NCBI上的拟南芥AtSWEEET12蛋白序列Blast比对苹果基因组中MdSWEEET12，后续可对其进行亚细胞定位、定量表达分析等一系列研究，进一步分析其在苹果中的功能，为苹果育种和优良品种选育奠定基础。