人血白蛋白含量测定方法探究

刘丽燕(阳江市检测检验中心，广东 阳江 529500)

0 引言

人血白蛋白是一种蛋白，它并不是人体自身产生的，而是从人的血清中制备而得到的，人血白蛋白的功效非常大，它能够调节人体血液的胶体渗透压，从而使人体机制恢复正常。人血白蛋白由健康人血浆经过低温乙醇工艺分离纯化，并经过60 ℃ 10 h加热灭活病毒后得到的血液制品。临床上，主要用于失血性创伤以及烧伤引起休克、脑水肿以及颅内损伤引起的颅内压升高、肝硬化以及肾病引起的腹水、低蛋白血症的防治、新生儿高胆红素血症、心肺复苏术以及烧伤的辅助治疗，血液透析的辅助治疗以及呼吸窘迫综合征的治疗[1]。现最权威的人血白蛋白含量是按照《中国药典》四部通则进行测定，其中有凯氏定氮法、福林酚法 、双缩脲法、2,2'-联喹啉-4, 4’二羧酸法、考马斯亮蓝法、紫外 -可见分光光度法，本次使用凯氏定氮法进行人血白蛋白含量测定，但具体的人血白蛋白凯氏定氮仪的测量参数还需要继续去探索，经过一系列条件检测，探索了以下最佳的人血白蛋白含量测定的仪器检测方法。本次实验进一步熟悉了蛋白质的含量测定和实验室能力验证的要求[2-4]，同时也提高了能力验证结果的满意水平[5-6]。

1 检测条件

1.1 仪器

(1)凯氏定氮仪K-360；(2)消解仪K436；(3)AB204-N型电子天平

1.2 试剂

氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸、硫酸钾试剂均采用分析纯；

水采用广州屈臣氏食品饮料有限公司的饮用水。

1.3 蛋白质检测方法设置

滴定类型：硼酸 蒸馏搅拌速度：5 s

滴定搅拌速度：7 s 反应时间：10 s

蒸汽力度：80% 蒸馏时间：480 s

开始滴定：480 s 水：50 mL

40%氢氧化钠：10 mL 2%硼酸：10 mL

2 供试品的制备

精密量取1.55 mL人血白蛋白[10 g/瓶(20% 50 mL)],至50 mL容量瓶中，加0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置消解管内，加硫酸钾0.3 g与30%硫酸铜溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0 mL，放入消解仪，安装完善，消解仪调到3档180 ℃消解5 min(去除水分)，调到6档350 ℃消解5 min(接近硫酸沸点)，调到7档410 ℃消解60 min，至溶液变成澄明的绿色，再继续消解10 min，取出，冷却。

3 实验操作步骤

按照说明书的要求将已冷却的消解管装入凯氏定氮仪的正确位置，关上安全门，连接水源。按照1.2的检测方法设置蛋白质含量测定的方法，其中水50 mL,氢氧化钠10 mL,硼酸10 mL。将配制好的40%的氢氧化钠，2%的硼酸和纯化水分别置自动蒸馏仪相应的大瓶中，用F=1.001的0.005 mol/L的硫酸滴定液自行自动滴定，记录数据。

4 含量测定检测结果及分析

4.1 滴定结果

滴定结果如表1所示。

表1 滴定结果 单位：mL

4.2 计算公式

蛋白质含量%=[F×T×(V终-V空)×V稀×6.25]/(W取×M标) ×100% (1)

式中：

F为滴定液的浓度值与其名义值之比，F=1.001；

T为 滴定度，T=0.140 1 mg/mL； V终为样品滴定体积；

V空为空白滴定体积；

V稀为样品稀释的体积，稀释体积=50 mL；

W取为样品取样量，取样量=1.55 mL；

M标为标示量，标示量=10 g/50 mL×1 000=200 mg/mL。

4.3 计算结果

计算结果如表2所示。

表2 计算结果

4.4 含量判定标准及结果分析

根据《中国药典》2015年版人血白蛋白含量标准的规定：应为标示量的95.0%～110.0%；综上所述，该人血白蛋白的含量在规定的范围内，是合格产品，该仪器检测方法适用于人血白蛋白的含量测定。

5 方法学验证

5.1 重复性试验

取同一供试品，供试品溶液制备方法按照《2015版中国药典》四部 通则0704制备6份供试品。按照正文含量测定方法，测定每份样品中蛋白质含量的滴定量，结果 RSD= 0.40%(n=6)，表明重复性良好(如表3所示)。

表3 测定样品中蛋白质含量的滴定量

6 讨论

6.1 氢氧化钠的影响

40%氢氧化钠的作用是中和硫酸，变成碱性条件，加热使氨气游离出来，硼酸吸收。配制注意事项是及时搅拌，在通风橱内配制，放凉后使用。若搅拌不及时容易结晶，那么溶液浓度容易达不到要求，所测结果会偏低。若很热使用，反应过于剧烈。另外氢氧化钠不纯的话，会导致空白数值不稳定，影响检测的准确性。同时，NaOH加的都是偏过量的，浓度偏差不大的情况下，对结果没有什么影响。

6.2 硼酸的影响

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，其中碳、氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵用NaOH中和生成NH3·H2O，加热又分解为氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸生成硼酸氨再以标准硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量计算蛋白质的含量。所以硼酸应过量使用，使产生的氨可以充分被吸收，确保滴定数据准确。

6.3 硫酸铜、硫酸钾与硫酸的影响

硫酸铜在整个消解反应中起到催化剂的作用，使蛋白质被分解；而硫酸则与被转化为的氨结合为硫酸铵，继续进行下一步的反应；硫酸钾就起到提高硫酸沸点的作用。

6.4 消解温度和时间的影响

整个消解过程需要有一个升温的过程，一下子升温太高，固体样品容易碳化导致实验失败，只有开始消解时，由小的消解温度到恒定，消解管整体才能受热均匀，一般泡沫不会溢出管外。同时初始消解时温度不可过低，过低造成消解时间延长。实验证明初始消解温度180 ℃为宜，只要消解管内无泡沫产生，并按照上述时间升温程序把温度提高到410 ℃左右，就可加快消解速度。

7 结语

根据上述的讨论进行思考，设计硼酸、氢氧化钠的加入量不同，探讨稀硫酸的滴定量，最终得出加入40%氢氧化钠10 mL，2%硼酸10 mL最为合适。同时，经过与消解仪工程师的沟通和经验得出消解仪调到3档180 ℃消解5 min(去除水分)，调到6档350 ℃消解5 min(接近硫酸沸点)，调到7档410 ℃消解60 min，至溶液变成澄明的绿色，再继续消解10 min，取出，冷却，这样的消解程序最为适合人血白蛋白的消解。经过方法学验证中的重复性RSD=0.40%(n=6)，表明重复性良好，该检测方法条件良好，适用人血白蛋白含量测定的检测。