肠道杯状细胞蓝染与苏木精pH值的关系

赵 茜，王安群，谢 刚，刘盛均

常规HE制片工作中，病理工作者使用相同的试剂及染色程序，但肠道杯状细胞胞质着色较重，而其他组织染色正常。肠道杯状细胞是由肠黏膜基底干细胞分化而来，形似高脚杯，内含黏液颗粒，HE染色通常呈淡蓝色或空泡状。由于肠道杯状细胞核质对比减弱，影响制片质量，严重时需要重新制片、更换苏木精试剂来达到满意的染色效果。然而，重新制片及更换新试剂会增大工作量及成本，还会造成组织损耗。本实验通过测量苏木精pH值找出导致肠道杯状细胞黏液着色重的原因，并进行调整达到良好的HE染色效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂收集2021年1月1日～5月30日四川省绵阳市中心医院病理科的石蜡组织25例，其中肠镜组织、胃镜组织、子宫颈组织、乳腺组织、阑尾组织各5例。赛默飞半自动切片机(HM340E)，漂片仪，樱花(Tissue-Tek Prisma Plus)全自动染色机，苏木精、伊红染液购自宁波察微生物公司；苏木精购自珠海贝索公司；phs-320酸度计、冰乙酸购自成都科隆公司；盐酸购自重庆川东公司。

1.2 方法实验室检测6种不同情况下苏木精pH值，取2例肠镜组织分别切片6张，经常规脱蜡至水后染色。染色步骤如下：苏木精5 min、水洗30 s、分化5 s、水洗30 s、碱化10 s、水洗30 s、伊红30 s，按75%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明封固。6种不同情况下苏木精染色，仅3号苏木精HE染色核质对比不清，胞质蓝染较重，网状，其余核质对比均清晰。因此，用3号苏木精进行后续实验(表1)。

表1 6种不同情况下的苏木精pH值及肠镜组织HE染色

将25例组织各切片3张，分为A、B、C三组，A组采用肠道杯状细胞黏液着色较重的3号苏木精试剂；B组采用冰乙酸调整pH值为2.49后的3号苏木精试剂；C组采用盐酸调整pH值为2.49后的3号苏木精试剂，染色步骤同上，分批次在樱花染色机内进行染色。

2 结果

HE染色结果显示，A组肠镜组织杯状细胞中出现较重的蓝染，核质对比不清(图1)；阑尾组织中出现少量较浅的杯状细胞黏液蓝染，胃镜、子宫颈、乳腺无异常着色。B组肠镜组织杯状细胞中无蓝染，呈空泡状，核质对比鲜明(图2)；胃镜、子宫颈、乳腺、阑尾组织核质对比鲜明，无异常着色。C组肠镜组织杯状细胞中无蓝染，呈空泡状，核质对比鲜明(图3)；胃镜、子宫颈、乳腺、阑尾组织核质对比鲜明，无异常着色。

①②

图3 肠镜组织染色(C组)：杯状细胞中无蓝染，呈空泡状，核质对比鲜明

3 讨论

肠道杯状细胞主要成分为酸性黏蛋白，苏木精水溶液是一种强酸试剂，色离子在水溶液中为阳离子，带正电荷。在不同环境下苏木精染液的pH值发生变化，肠黏膜上皮杯状细胞经HE染色也会呈现不同的染色效果。当苏木精pH值为2.49时，肠道杯状细胞黏蛋白大部分不着色；当苏木精pH值大于2.52时，其为蓝色呈网状，并随着苏木精pH值升高而加重；当pH值为2.85时出现较重的蓝染。根据细胞质蛋白质着色原理分析，当pH值为2.52时，肠道杯状细胞分泌的酸性蛋白与苏木精结合，发生酸式电离带负电荷，其等电点(约2.52)偏低，易与苏木精试剂结合，苏木精试剂pH值升高是引起肠道杯状细胞黏蛋白蓝染的直接原因[1-2]。在阑尾组织中也存在杯状细胞蓝染现象，但与肠组织相比阑尾组织杯状细胞量少，分泌的酸性黏蛋白较少，黏蛋白蓝染较轻，对HE切片质量影响较小。实际工作中，肠道杯状细胞黏蛋白蓝染的情况，随着切片染色量增多呈逐渐加重的趋势。在HE染色时切片脱蜡至水后，染色架和载玻片残留的水分会进入苏木精试剂，实验用水pH值约7.05，水分的进入将导致苏木精pH值随着染片量增加而不断升高，当升高至2.54及以上时，肠道杯状细胞中开始出现较多的黏液蓝染。影响染色架和载玻片水分残留量的主要因素：染色机的机械臂有无抖动功能、载玻片进入苏木精试剂的速度以及载玻片的种类。当染色机的机械臂无抖动功能、载玻片进入苏木精试剂速度越快、载玻片种类引起的自身水分残留越多，苏木精试剂pH值升高将随之加快。通过以上分析，在染色量比较大的实验室，为了延长苏木精的使用寿命，可用冰乙酸和盐酸调整苏木精pH值；其中冰乙酸比盐酸更易操作。如果条件允许可以调整染色机程序，在脱蜡至水后增加一步空缸，避免染色架和载玻片过快进入苏木精试剂，减少水分残留，可根据各地气候温度进行调整，此操作步骤时间不宜过长，避免切片过于干燥造成不良染色。在选择载玻片时，水分残留情况也应作为重要的考虑因素。在手工染色的实验室为了延长苏木精的使用寿命，也应尽量避免过多的水分带入苏木精染液中。如果实验室不具备调整pH值的条件，可以将出现肠道杯状细胞不良染色的苏木精试剂，用于妇科液基细胞染色或用于冷冻染色等。

综上所述，本实验通过调整苏木精试剂pH值和延缓苏木精pH值升高的方法，延长其使用寿命。苏木精试剂在病理科比较常用，采用厂家配置好的成品，价格较高。了解苏木精特性，更加合理有效使用苏木精试剂，可有效提高制片质量及降低病理科损耗。