miR-185在弥漫大B细胞淋巴瘤细胞黏附介导耐药中的作用

缪小兵，张邢松，陈卓琳，尹海兵

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是常见的恶性淋巴瘤[1]，越来越多的证据表明，耐药是治疗DLBCL的重要挑战。现已证实，肿瘤细胞与纤连蛋白(fibronectin, FN)的黏附可导致耐药表型，称为细胞黏附介导的耐药(cell adhesion mediated-drug resistance, CAM-DR)[2-3]。据文献报道，miR-185在调节肿瘤耐药中具有重要作用。miRNA是18～24个核苷酸组成的非编码RNA，可在转录后调节基因表达[4]。Lin等[5]发现，过表达miR-185可提高酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)治疗无反应的慢性粒细胞白血病干细胞/祖细胞对TKI的敏感性。目前，miR-185在DLBCL CAM-DR中的作用尚不清楚。文献报道，PYK2在肿瘤微环境介导的多发性骨髓瘤耐药中发挥关键作用[6-7]。PYK2是由PTK2B编码的非受体酪氨酸激酶，参与感知细胞对细胞外基质的黏附。本研究通过生物信息学方法发现人PTK2B基因的3′非翻译区(untranslated region, UTR)含miR-185作用位点，采用慢病毒感染技术通过抑制或过表达miR-185，分析miR-185对PYK2的调节作用，并观察其对DLBCL CAM-DR的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株人DLBCL细胞OCI-Ly8由复旦大学附属肿瘤医院周晓燕教授惠赠，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。人DLBCL细胞OCI-Ly10及人胚肾HEK-293T细胞购自南京科佰生物公司。OCI-Ly10细胞培养于含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中；HEK-293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.2 主要试剂FN购自美国Sigma-Aldrich公司，Phospho-PYK2(Tyr402)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，PYK2抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，GAPDH抗体购自武汉Proteintech公司。Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)及Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 购自美国Jackson Immuno Research Laboratories公司，Trizol试剂购自美国Life Technologies公司，RevertAid第一链cDNA合成试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒、miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒及miRcute Plus miRNA qPCR试剂盒购自北京天根生物公司。台盼蓝拒染试剂盒购自上海碧云天生物公司。FAK/PYK2激酶抑制剂PF-562271购自上海MedChemExpress公司，Dual-Glo荧光素酶系统购自美国Promega公司。

1.3 细胞黏附细胞培养板预先用50 μL FN(40 μg/mL)包被过夜，使用PBS洗涤2次，将DLBCL细胞轻轻重悬于无血清培养基中。随后将细胞接种于96孔板(每孔5×104个细胞)中，并在37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养24 h。无血清培养基洗涤3次去除未黏附细胞。

1.4 慢病毒感染miR-185上调/下调慢病毒及PYK2过表达慢病毒购自上海吉凯基因公司，慢病毒感染严格按试剂盒说明书进行。

1.5 qPCR检测PTK2B mRNA分析：Trizol试剂分离总RNA后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将分离的RNA反转录为cDNA，使用SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒进行扩增。miR-185分析：利用miRcute miRNA分离试剂盒分离RNA后，使用miRcute miRNA cDNA试剂盒将分离的RNA反转录为cDNA，使用miRcute miRNA qPCR试剂盒进行扩增。PTK2B引物序列：正向5′-GTCAGCCATGTTCTCAGCCT-3′；反向5′-ACTAGT CAGGACGCAAAGCC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向5′-CACCCT GTTGCTGTAGCCAAA-3′；miR-185引物序列：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3′；反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物序列：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′；反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.6 Western blot法收集细胞裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，PVDF膜转印后用含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，二抗室温孵育2 h，PBST洗涤3次后ECL液显影。Phospho-PYK2(Tyr402)按1 ∶1 000比例稀释；PYK2按1 ∶500比例稀释；GAPDH按1 ∶5 000比例稀释；Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)及Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 均为1 ∶10 000比例稀释。

1.7 荧光素酶报告基因检测利用生物信息学方法预测miR-185与PTK2B的结合位点，将PTK2B 3′ UTR上的miR-185潜在结合位点克隆至GV272(SV40-firefly_Luciferase-MCS)载体中，构建野生型PTK2B 3′ UTR荧光素酶报告载体；将结合位点进行突变，构建结合位点突变型PTK2B 3′ UTR荧光素酶报告载体。将构建的3′ UTR载体与miR-185 mimics、Renilla 质粒共转染HEK-293T细胞转染48 h，收集细胞使用Dual-Glo荧光素酶系统检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值。

1.8 台盼蓝拒染实验收集处理的细胞，用PBS洗涤2次，重悬于PBS中，将10 μL细胞悬液与10 μL 0.4%台盼蓝溶液混合1 min。使用血球计数板计数活细胞以及死亡细胞数目(死亡细胞被染成淡蓝色，活细胞为无色透明状)，细胞死亡比例(%)=死亡细胞总数/(活细胞总数+死亡细胞总数)×100%。

2 结果

2.1 DLBCL细胞与FN黏附对miR-185及PYK2表达的影响采用qPCR检测发现，OCI-Ly8与FN黏附培养组、悬浮培养组中miR-185的表达：(0.17±0.07)vs(1.01±0.11)(t=9.05，P<0.001)；OCI-Ly10细胞与FN黏附培养组、悬浮培养组中miR-185表达：(0.35±0.15)vs(1.01±0.15)(t=4.50，P=0.011)；提示OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可下调miR-185表达(图1A)。Western blot检测发现，OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平(图1B)。

图1 A. qPCR检测悬浮及黏附培养状态下miR-185的表达，*P<0.05，***P<0.001；B. Western blot法检测悬浮及黏附培养状态下PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)的表达

2.2 miR-185对PYK2表达的影响Western blot法检测发现，在悬浮及FN黏附培养状态下，敲低miR-185可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平(图2A、B)。OCI-Ly8细胞悬浮培养状态Ctrl组与miR-185组中PTK2B mRNA的表达：(1.01±0.21)vs(0.95±0.36)(t=0.24，P=0.819)；OCI-Ly8细胞黏附培养状态Ctrl组与miR-185组中PTK2B mRNA的表达：(1.33±0.10)vs(1.36±0.21)(t=0.23，P=0.833，图2C)。OCI-Ly10细胞悬浮培养状态Ctrl组与miR-185组中PTK2B mRNA的表达：(1.01±0.19)vs(0.98±0.16)(t=0.21，P=0.844)；OCI-Ly10细胞黏附培养状态Ctrl组与miR-185组中PTK2B mRNA的表达：(1.31±0.10)vs(1.20±0.21)(t=0.79，P=0.472，图2D)；提示过表达miR-185并不显著影响悬浮及FN黏附培养状态下PTK2B mRNA的表达水平。在HEK-293T细胞中过表达miR-185后，3′UTR空载体组与野生型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性：(1.00±0.06)vs(0.49±0.04)(t=9.54，P<0.001)；3′UTR空载体组与突变型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性：(1.00±0.06)vs(0.94±0.06)(t=1.01，P=0.371)；野生型PTK2B 3′UTR组与突变型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性：(0.49±0.04)vs(0.94±0.06)(t=8.65，P<0.001)；提示过表达miR-185可降低野生型PTK2B 3′UTR荧光素酶报告基因活性，但并不显著影响突变型PTK2B 3′UTR荧光素酶报告基因活性(图2E)。上述结果表明miR-185可靶向调节PYK2。

图2 miR-185对PYK2表达的影响：A. Western blot法检测OCI-Ly8细胞中PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平：shCtrl.对照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下调慢病毒； B. Western blot检测OCI-Ly10细胞中PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平：shCtrl.对照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下调慢病毒；C. qPCR检测OCI-Ly8细胞中PTK2B mRNA表达水平：Ctrl.对照慢病毒；miR-185.miR-185上调慢病毒；D. qPCR检测OCI-Ly10细胞中PTK2B mRNA表达水平：Ctrl.对照慢病毒；miR-185.miR-185上调慢病毒；E.荧光素酶报告基因实验分析miR-185对PTK2B 3′UTR活性的影响：空载体. 3′UTR空载质粒；野生型.野生型PTK2B 3′UTR报告基因质粒；突变型.突变型PTK2B 3′UTR报告基因质粒，***P<0.001，#P>0.05

2.3 miR-185、PYK2对DLBCL细胞CAM-DR的影响台盼蓝拒染实验显示，OCI-Ly8细胞悬浮培养状态下shCtrl+Doxo(多柔比星)组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(76.33±12.08)%vs(41.40±14.05)%(t=3.27，P=0.031)。OCI-Ly10细胞悬浮培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(69.90±6.61)%vs(43.77±8.19)%(t=4.30，P=0.013)。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(39.43±3.94)%vs(26.93±6.25)%(t=2.93，P=0.043)。OCI-Ly10细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(43.67±9.66)%vs(16.10±3.42)%(t=4.66，P=0.009，)。结果显示，在OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞中敲低miR-185可抑制悬浮及黏附培养状态下Doxo诱导的细胞死亡(图3A、B)。OCI-Ly8细胞悬浮培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例：(58.73±8.55)%vs(39.97±3.19)%(t=3.56，P=0.024)。OCI-Ly10细胞悬浮培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例：(59.33±8.73)%vs(33.30±6.50)%(t=4.14，P=0.014)。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例：(37.70±7.64)%vs(20.07±7.59)%(t=2.84，P=0.047)。OCI-Ly10细胞黏附培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例：(34.00±5.46)%vs(14.37±3.46)%(t=5.26，P=0.006)。结果显示，过表达PYK2可抑制悬浮及黏附培养状态下Doxo诱导的细胞死亡(图3C、D)。上述结果表明，细胞黏附介导的miR-185下调和PYK2表达增加，可促进CAM-DR。

图3 miR-185、PYK2对DLBCL细胞CAM-DR的影响：A.台盼蓝拒染实验检测敲低miR-185对OCI-Ly8细胞CAM-DR的影响：shCtrl.对照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下调慢病毒；shCtrl+Doxo.对照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下调慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；B.台盼蓝拒染实验检测敲低miR-185对OCI-Ly10细胞CAM-DR的影响：shCtrl.对照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下调慢病毒；shCtrl+Doxo.对照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下调慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；C.台盼蓝拒染实验检测过表达PYK2对OCI-Ly8细胞CAM-DR的影响：Ctrl.对照慢病毒；PYK2. PYK2过表达慢病毒；Ctrl+Doxo.对照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；PYK2+Doxo.PYK2过表达慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；D.台盼蓝拒染实验检测过表达PYK2对OCI-Ly10细胞CAM-DR的影响：Ctrl.对照慢病毒；PYK2. PYK2过表达慢病毒；Ctrl+Doxo.对照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；PYK2+Doxo.PYK2过表达慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；*P<0.05，**P<0.01

2.4 PF-562271对DLBCL细胞CAM-DR的影响台盼蓝拒染实验显示，OCI-Ly8细胞悬浮培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(54.03±5.21)%vs(40.33±3.15)%(t=3.90，P=0.018)；OCI-Ly10细胞悬浮培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(60.87±6.26)%vs(39.70±5.12)%(t=4.53，P=0.011)。OCI-Ly8细胞悬浮培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例：(40.33±3.15)%vs(58.13±5.59)%(t=4.81，P=0.009)；OCI-Ly10细胞悬浮培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例：(39.70±5.12)%vs(55.07±7.43)%(t=2.95，P=0.042)。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(34.37±3.72)%vs(25.03±3.30)%(t=3.25，P=0.031)；OCI-Ly10细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例：(40.50±3.63)%vs(27.50±6.52)%(t=3.02，P=0.039)。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例：(25.03±3.30)%vs(39.37±5.06)%(t=4.11，P=0.015)；OCI-Ly10细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例：(27.50±6.52)%vs(47.53±9.43)%(t=3.03，P=0.039)。结果显示，FAK/PYK2双重抑制剂PF-562271可显著增加悬浮及黏附培养状态下Doxo诱导的细胞死亡(图4A、B)。上述研究结果提示PF-562271可抑制miR-185下调介导的CAM-DR表型。在DLBCL中miR-185下调，可能通过介导PYK2 表达增加来促进CAM-DR。

图4 台盼蓝拒染实验检测PF-562271对DLBCL细胞CAM-DR的影响：A.OCI-Ly8细胞；B. OCI-Ly10细胞；shCtrl+Doxo.对照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下调慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo+PF-562271.miR-185下调慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星+4.0 μmol/L PF-562271；*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

miR-185表达异常与多种造血和非造血系统恶性肿瘤的发生、发展有关。Ni等[8]报道，miR-185在胶质瘤中下调，敲低miR-185可增强U251和U87细胞的迁移能力，并显著抑制细胞凋亡。此外，有研究发现miR-185在结直肠癌中的表达低于正常肠黏膜组织；miR-185低表达与结直肠癌转移相关。 miR-185可通过靶向树突状细胞特异C型凝集素DC-SIGN降低MMP-9和VEGF的表达。miR-185/DC-SIGN通过使PI3K/Akt/GSK-3β信号通路失活抑制β-catenin的核转位[9]。Afshar等[10]报道，上调miR-185的表达可增强结直肠癌细胞的放疗敏感性。Wang等[11]研究发现，过表达miR-185可抑制A549和H460肺癌细胞的增殖和转移，并促进肿瘤细胞凋亡。在肺鳞癌H520细胞中，过表达miR-185可以部分逆转lncRNA PART1(prostate androgen regulated transcript 1)对细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡影响[12]。现已证实，miR-185在调节肿瘤耐药中发挥重要作用。过表达miR-185可增强胃癌细胞对低剂量化疗药物的敏感性；而敲低miR-185可降低大剂量化疗诱导的细胞凋亡[13]。最新一项研究报道，在TKI治疗无反应的慢性粒细胞白血病干细胞/祖细胞中过表达miR-185可以下调PAK6的表达，进而抑制细胞存活并增强TKI的敏感性[5]。本组结果显示，与悬浮培养相比，OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可显著下调miR-185的表达水平，细胞黏附介导的miR-185下调可促进CAM-DR。

PYK2属于FAK激酶家族，在调控细胞生长、存活、迁移和侵袭中发挥重要作用[14]。文献报道，PYK2在多种肿瘤如乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、白血病、结肠癌、卵巢癌中表达增加[15]。PYK2表达异常与多种肿瘤的增殖相关，如三阴型乳腺癌[16]、多发性骨髓瘤[6]、小细胞肺癌[17]。有研究报道，PYK2在调控肿瘤耐药中发挥关键作用。Verma等[16]报道，在三阴型乳腺癌中，敲低PYK2可通过抑制HER-3上调，继而抑制HER-3相关耐药。Meads等[6]研究发现，在多发性骨髓瘤中肿瘤细胞与FN黏附可引起PYK2磷酸化，继而促进STAT3磷酸化；在骨髓微环境中，靶向PYK2可诱导肿瘤细胞的死亡，并抑制肿瘤细胞的生长。本组实验发现，OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平。PYK2上调可促进CAM-DR。此外，实验还发现PF-562271可显著增加悬浮及黏附培养状态下Doxo诱导的OCI-Ly8和OCI-Ly10细胞死亡，抑制miR-185下调介导的CAM-DR表型。

综上所述，本实验发现DLBCL细胞与FN黏附培养可下调miR-185表达，并上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平。在DLBCL中miR-185可靶向抑制PYK2，细胞黏附介导的miR-185下调，可能通过诱导PYK2表达增加促进CAM-DR。FAK/PYK2双重抑制剂PF-562271，可抑制miR-185下调介导的CAM-DR表型。本实验仅通过体外实验初步分析miR-185和PYK2在DLBCL CAM-DR中的作用，体内实验中两者是否影响DLBCL耐药仍有待进一步验证。因此，深入探讨miR-185和PYK2在DLBCL中的作用及分子机制，可为后续逆转肿瘤细胞耐药的研究提供实验数据。