不同核酸提取方法和新型冠状病毒核酸检测试剂室间质评结果分析*

余汉忠,牛璐璐,孔倩倩,李小川,蔡佩君,王丽

(1.中国矿业大学附属医院 徐州市第一人民医院检验科, 江苏徐州 221009；2.中国矿业大学化工学院, 江苏徐州 221009)

2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)核酸检测在疫情防控中至关重要。各厂家快速研发的各种核酸提取和检测试剂盒并不稳定[1]，在检测前需要进行充分的性能验证及试剂比对，并积极开展实验室间的室间质评比对活动，才能确保检测结果的准确和可靠。本研究对徐州市第一人民医院PCR实验室采用的2种核酸提取方法和2种2019-nCoV核酸检测试剂检测室间质评样本的结果进行比较分析，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1样本 2020年江苏省临床检验中心5月17日发放的2019-nCoV核酸检测室间质量评价样本5份(样本号：209601、209602、209603、209604、209605)和2020年国家卫生健康委临床检验中心6月17日发放的2019-nCoV核酸检测室间质量评价样本10份(样本号：202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009、202010)。

1.2仪器与试剂 SLAN-96P全自动荧光PCR仪(上海宏石公司)，AW-1000全自动核酸提取仪(江苏硕世公司)；新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(批号：20200302)、磁珠法核酸提取试剂盒(批号：SDK60105)源自江苏硕世公司(A公司)，新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(批号：2020076)、核酸释放剂(批号：2020043)源自湖南圣湘公司(B公司)。

1.3方法 接收室间质评样本当天即进行检测。根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第五版)》[2]要求进行生物安全防护。根据核酸提取和扩增试剂的不同，分为3种组合。组合1：A公司磁珠法核酸提取试剂+核酸检测试剂，组合2：B公司核酸释放剂+核酸检测试剂，组合3：A公司磁珠法核酸提取试剂+B公司核酸检测试剂。

1.3.1核酸提取 (1)磁珠法：用A公司核酸提取试剂盒及AW-1000全自动核酸提取仪，质评样本充分混匀后，吸取200 μL加入相应深孔板第一列，放入提取仪，选择相应程序自动提取；(2)核酸释放剂法：八联管中加入10 μL B公司样本核酸释放剂，质评样本充分混匀后，吸取10 μL加入八联管，充分混匀，静置10 min。均按照试剂说明书进行。

1.3.2核酸扩增 用SLAN-96P全自动荧光PCR仪及核酸检测试剂，根据试剂说明书配制反应体系并设置反应程序，进行扩增检测及检测结果判定。

A公司核酸检测试剂PCR反应体系共25 μL，包括RT-PCR反应液7.5 μL，酶混合液5 μL，新冠三重反应液4 μL，去RNA酶H2O 3.5 μL，核酸模板样本量5 μL。PCR扩增参数为：逆转录50 ℃ 30 min；预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 40 s，退火、延伸、测荧光55 ℃ 40 s，45个循环。结果判读：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(内标)3个通道Ct≤35且扩增曲线为S形曲线者，判定为该基因检测结果为阳性；Ct>38判定为该基因检测结果为阴性；35

B公司核酸检测试剂的PCR反应体系共50 μL，包括RT-PCR反应液26 μL，酶混合液4 μL，核酸模板样本量20 μL；PCR扩增参数为：逆转录50 ℃ 30 min；预变性95 ℃ 1 min；变性95 ℃ 15 s，退火、延伸、测荧光60 ℃ 30 s，45个循环；冷却25 ℃ 10 s。结果判读：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(内标)3个通道Ct≤40且扩增曲线为S形曲线者判定为该基因检测结果为阳性，Ct>40判定为该基因检测结果为阴性，扩增曲线异常时需复查。

1.3.3质量控制 试剂盒自带阴性和阳性对照，若阴性和阳性对照检测结果在控，则该批次试验结果有效；若阴性和阳性对照检测结果不在控，则该批次试验结果无效。设置环境评估样本1个，为阴性对照开口放置于PCR实验室Ⅱ区过夜，用质评样本检测方法检测，评估有无环境污染。

2 结果

本实验室根据标准操作规程进行操作后结果良好，阴性对照、阳性对照、环境评估样本均在控制范围内。根据国家卫生健康委临检中心和江苏省临床检验中心的室间质评结果回报，除209602、209604、202001、202006、202008号样本为双位点未检出外，其余室间质评样本均为双位点阳性。3种试剂组合对阴性质评样本均为未检出，阴性结果符合率均为100%，对阳性质评样本各基因的检出结果见表1。

3 讨论

准确的2019-nCoV病原鉴定对新型冠状病毒肺炎疑似患者治疗方案的确定、感染的控制都发挥着关键作用[3-4]。本研究选取了徐州市第一人民医院现在使用的2种2019-nCoV核酸检测试剂及2种提取方法对室间质评样本进行分析。从实验结果可以看出，磁珠法提取的核酸用A和B公司核酸检测试剂检测的有效检出率都能达到100%。但B公司核酸释放剂法提取后的核酸使用B公司核酸检测试剂对阳性质评样本ORF1ab基因的检出率为70%，N基因检出率为90%，说明核酸提取效果不佳。而磁珠法提取的核酸再用B公司核酸检测试剂检测质评样本的结果表明，所有阳性样本的Ct值均小于其他2种组合，说明此试剂组合对室间质评阳性样本均能更灵敏地检出靶基因[5]。

本实验仅对2种某一批号的试剂用国家卫健委临检中心和江苏省临床检验中心的室间质评样本作了简单的比较分析，因为样本量较少，可能并不代表2种试剂的整体检测能力。目前国内疫情放缓，研究对象缺乏，若能获取大数量的阳性样本，可以对不同提取和扩增试剂进行更全面的评价。