循环生物标志物在预测非小细胞肺癌免疫治疗反应的研究进展

杜凤华 梅晓冬

检查点阻断免疫疗法的出现，使癌症治疗发生了革命性的变化。目前已经有超过七种免疫治疗药物已经获得FDA批准，并具有多种适应症，还有不计其数的药物正在进行临床试验研究。然而，临床对免疫治疗的反应在个体患者和癌症类型之间存在高度异质性。这对临床医生在选择个性化药物进行特异性免疫治疗提出了挑战。因此，在治疗开始前预测肿瘤对免疫治疗的反应性是非常有价值的。最早提出的预测癌症免疫治疗反应的生物标志物是基于PD1和PDL1表达，但其预测价值似乎仅限于特定的癌症或患者群体。利用下一代测序技术对循环肿瘤细胞和宿主细胞进行单细胞分子分析的最新进展，极大地扩大了潜在有用的预测生物标志物的范围。本文回顾了基于生物标志物的无创预测和肿瘤对免疫治疗反应治疗中监测的最新进展，着重总非小细胞肺癌的循环标志物。

免疫治疗概述

循环液体活检生物标志物是预测和跟踪检查点阻断免疫治疗反应的非侵入性指标，对非小细胞肺癌具有最高质量的证据。目前癌症免疫治疗有三大生物标志物，第一类系反应肿瘤炎症状态的生物标志物，即PDL1表达，肿瘤PDL1表达并不能充分表达宿主免疫学和肿瘤微环境的复杂性，其预测价值似乎仅限于特定的癌症或患者群体。第二类标志物则揭示肿瘤的免疫原性，循环肿瘤DNA、血液肿瘤突变负荷(TMB)、转录组特征、循环肿瘤细胞和宿主免疫标志物是最有希望转化为临床应用的下一代液体活检生物标志物。第三类标志物系宿主环境，如微生物环境等。选择炎症生物标志物来预测肿瘤对检查点阻断免疫治疗的反应，必须要与个体的遗传背景、肿瘤微环境和免疫学特征之间的相互关联。基因组学和蛋白质组学方法的结合，配合人工智能和下一代测序技术的进步，将使癌症免疫治疗向个体化医学过渡。

癌症免疫治疗的目的是通过免疫检查点阻断(ICB)来帮助免疫系统识别并攻击癌细胞。检查点阻断免疫疗法(CBI)的研究爆炸式增长，要归功于其显著提高了多种癌症生存率。FDA批准的CBI适应症，包括非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌等，以及正在进行的临床试验中其他多种肿瘤治疗组合。尽管CBI取得了成功，但在将临床获益扩大到更多患者方面仍存在一些障碍。虽然检查点免疫疗法对确实达到临床反应的患者效果很好，但也有一部分患者对相同的治疗没有反应或反应较差。此外，对于哪种客观指标能够最好地预测临床反应，还没有达成共识。确定这些指标将使临床医生能够在开始治疗前选择特定的治疗方法，并在整个治疗过程中对治疗策略进行监测时，对治疗策略进行潜在的调整和修改。直接从肿瘤标本中获得的反映肿瘤免疫微环境和肿瘤细胞内在特征的生物标志物，已被研究作为对CBI反应的潜在标志物。例如瘤内PDL1表达、肿瘤浸润淋巴细胞密度(TIL)[1]、肿瘤突变负荷(TMB)[2]、DDR(肿瘤损伤修复)[3]等，这些都被认为与CBI的治疗效果有关。然而，这些生物标记物需要侵入性取样，而且从风险-收益的角度来监测治疗过程中的肿瘤反应并不实用。循环液体活检生物标志物最近显示出作为肿瘤免疫治疗反应预测指标的前景，并将随时间推移逐渐成为趋势。本篇综述简要概述了FDA批准的检查点阻断免疫疗法、它们的作用机制以及检查点抑制剂的基本免疫学。然后，综合近年来发表的研究成果，确定预测非小细胞肺癌免疫疗法临床反应的潜在生物标志物，并识别有前途的生物标志物以期加快个性化药物在非小细胞肺癌免疫治疗中的应用。

作用检查点抑制剂免疫治疗的药物种类和作用机制是旨在阻断细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)通路或程序性细胞死亡蛋白1通路(PD1/PDL1)的单克隆抗体。目前，FDA批准的癌症免疫治疗药物有ipilimumab (CTLA4)、nivolumab (PD1)、pembrolizumab (PD1)、atezolizumab (PDL1)、avelumab (PDL1)、durvalumab (PDL1)和cemiplimab (PD1)。Ipilimumab是FDA唯一批准的以CTLA4为基础的疗法，也是第一个上市的免疫疗法。在正常的T细胞介导的免疫反应中，T淋巴细胞在体内巡视，寻找感染、疾病或癌症的迹象。通过T细胞受体(TCR)识别不健康细胞或抗原递呈细胞(APCs)上的肽抗原，可导致T细胞活化和增殖。T细胞表面通常也表达PD1和CTLA4，它们是抑制受体，当分别与配体PDL1或CD80/CD86结合时，可以阻止T细胞活化。肿瘤可能通过异常表达PDL1或CD80/CD86来逃避这种监测，这些异常表达可以激活PD1或CTLA4，从而抑制T细胞的活化和增殖。本篇综述将主要关注检查点阻断免疫疗法治疗非小细胞肺癌患者的研究。

循环标志物对免疫治疗反应

用于预测免疫治疗反应的大多数生物标志物可以分为基因组和蛋白质组标志物。基因组学研究的例子包括循环肿瘤细胞的全外显子组测序,裸细胞游离DNA (cfDNA)或循环肿瘤DNA (ctDNA)[4]的分析，以及宿主免疫细胞的RNA转录组特征。蛋白质组学标记包括存在于循环中的可溶性蛋白，如宿主细胞因子和趋化因子，或循环肿瘤或免疫细胞上的细胞表面标记，如PD1/PDL1和TCRs。另一类可预测免疫治疗反应的可溶性生物标志物是外泌体和细胞外囊泡。PDL1表达是第一个被提出的预测CBI治疗反应的蛋白组生物标志物，因为许多研究发现，在CBI患者中，肿瘤通过免疫组织化过度表达PDL1，改善了临床结果。然而，大量PDL1水平较低的患者也表现出较强的反应，这使得使用PD1/PDL1作为唯一的生物标志物变得复杂。此外，PDL1的评估方法是异质性的，这使得比较不同试验之间的重现性有所不同。其他蛋白质组生物标志物与宿主免疫学有关。例如，中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)已被发现是许多实体肿瘤生存的预后指标。

一、非小细胞肺癌

目前，PDL1是非小细胞肺癌(non -small cell lung cancer, NSCLC)中唯一在临床应用中选择最可能受益于CBI的患者的生物标志物。目前针对于PD1/PDL1的免疫检查点抑制剂(ICIs)在非小细胞肺癌的一线、二线甚至早期的临床治疗已经得到广泛证实[5-7]。全外显子组测序(WES)或癌症基因面板(CGP)[8]是目前已知的预测免疫疗法反应监测手段，用于估计突变负荷，预测PD-1阻滞的临床疗效。研究表明下一代基因测序技术(NGS)能准确估计TMB, TMB的升高进一步提高了ICIs获益的可能性。TMB与PD-L1表达无相关性，两个变量的预测能力相似。将TMB和PD-L1表达结合到多变量预测模型中，可以获得更高的预测能力[9]。多项研究均表明CTC计数可单独或者联合CYFRA21-1可作为检测早期肺癌的依据，其表达与远处转移密切相关，并可为疾病复发和转移提供依据[10]。在对24例接受nivolumab治疗的四期NSCLC患者的研究中，PDL1阴性CTCs患者均获得临床获益，而PDL1阳性CTCs患者均经历疾病进展[11]。然而，循环血液中ctDNA估计的TMB (bTMB)是否与免疫治疗的临床结果有关仍有待探索。在一项136名非小细胞肺癌患者研究中,更高的ctDNA突变负荷明显与不良临床CBI结果相关[12],这表明ctDNA可能反映了与肿瘤DNA不同的基因组特征。肿瘤突变负荷(TMB)，通过全外显子组测序(WES)或肿瘤基因板(CGP)测量，与免疫治疗反应有关[13]。在后来的一项研究中，基于血液的TMB预测了阿特利珠单抗对NSCLC的临床益处，并通过对两项大型随机试验的回顾性分析证实了这一点。最近，一种用于肺癌患者筛查的血浆免疫相关miRNA-signature classifier (MSC)被应用，以确定它是否也可以预测NSCLC对CBI的反应，他们发现MSC检测与总体和无进展生存相关[14]。ctDNA水平可以使早期评估免疫治疗效果。ctDNA水平的下降是治疗效果的早期标志，预示着接受免疫检查点抑制剂治疗的NSCLC患者的生存期延长。总的来说，ctDNA是一种非常有前途的非小细胞肺癌生物标志物。目前正在探索免疫宿主相关的生物标志物作为对CBI反应的潜在预测因子。在最近的一项研究中收集了2015至2016年201例接受nivolumab的患者中，ECOG 性能状态≤ 2, ALB(血清白蛋白) <3.7 g/dL, NLR(中性粒细胞与淋巴细胞比率)≥4, ALI(炎症指数=BMI×ALB/NLR)<18 、PFS差和早期进展显著相关[15]。175例患者接受nivolumab的研究中，多变量分析提示中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)≥5与患者OS独立相关[16]。在一项对70例初治NSCLC患者的研究中，生存期下降与PD1+、PD1+CD3+、PDL1+CD3+、PDL1+CD3+CD8+、PDL2+CD3+、PDL2+CD3+CD4+或PDL2+CD3+CD8+PBMCs水平升高有关，且细胞因子IL-2和TNF-α与响应患者中T细胞上PDL1的表达密切相关[17]。

二、其他癌种

与非小细胞肺癌相比，其他癌症的通用生物标志物的研究较少，本文总结了这些研究的一小部分结果。在一项对49名黑色素瘤患者的前瞻性研究中，使用定量的19个基因数字RNA标记(CTC评分)治疗后7周内CTC评分的下降与无进展生存期的显著改善相关[危险比(HR,0.17;P=0.008)]和总生存率(HR, 0.12;P=0.04)[18]。另一项对35例CTLA4和PD1联合阻断治疗患者的研究中，从治疗前和治疗中反复的液体活检中研究了710个肿瘤相关基因。从ctDNA中提取的TMB在应答者中高于非应答者，其截断值为TMB>23.1。此外，在治疗的前3周，TMB的减少超过50%，导致总生存率增加[19]。在头颈部肿瘤中，抗PD1药物已成为治疗铂类难治性复发/转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的标准药物。在一项113例HNSCC患者的前瞻性研究中，检测过表达PDL1的CTCs对HNSCC的预后有重要意义。与没有治疗结束时相比，治疗结束时PDL1的过度表达具有较差的存活率[20]。PD-L1在黑色素瘤肿瘤细胞中的表达低于NSCLC或肾细胞癌细胞。PD-1抑制剂治疗黑色素瘤患者的较高应答率可能与肿瘤相关炎症细胞中的PD-L1有关。炎症细胞PD-L1表达在黑色素瘤中的预测作用及生物学意义有待进一步研究[21]。

总结与展望

本篇综述，先简要概述了FDA批准的检查点阻断免疫疗法及其作用机制，然后总结了近年来发表的主要研究结果，确定了非小细胞肺癌相关检查点阻断免疫疗法临床反应的潜在指标预测。一些研究已经确定循环肿瘤DNA和肿瘤突变负荷是预后因素。循环蛋白组学标志物如细胞因子/趋化因子、特异性肿瘤免疫细胞(如中性粒细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞)的数量或比例也具有较高的预测价值。作为这些潜在预测因子的现有证据，需要共识和标准化才能将这些生物标志物广泛应用于更大的患者群体。除PD1/PDL1外，最有前途的生物标志物策略包括循环肿瘤DNA和细胞DNA的基因组分析(微卫星不稳定性、特异性肿瘤突变、DNA损伤)、肿瘤突变负荷以及宿主免疫学的蛋白质组和转录组特征。虽然我们的研究重点是预测非小细胞肺癌对检查点抑制剂免疫治疗反应的生物标志物，但其免疫治疗模式也正在基础研究和临床试验中得到很好的探索。目前尚无循环生物标志物预测肿瘤对CART细胞免疫治疗反应的研究，需要做更多的工作来识别这些生物标志物。在更广泛的非侵入性生物标志物中，最近的两项研究已经确定了基于多模态靶向成像的肿瘤反应生物标志物，称为放射组学[22,23]。例如，随着针对各种癌症的新型示踪剂的开发，正电子发射断层扫描(PET)可以成为另一种非侵入性和定量的策略监测治疗方法。

总之，使用生物标志物的组合来预测免疫治疗疗效似乎已经成为不可避免的趋势，特别是对于非小细胞肺癌。问题在于如何组合，并找到对患者最适合的检测技术。在未来，基因组学和蛋白质组学方法的整合将与人工智能和下一代测序进一步结合，使非小细胞肺癌免疫疗法向个体化医疗大幅度迈进。