肾上腺髓质素对高氧肺损伤的保护作用研究

张敏 成利花 殷晓桐 罗好 蔡成

（上海交通大学附属儿童医院/上海市儿童医院新生儿科，上海 200062）

多种因素导致支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的发生，目前已知与早产的相关性最强，肺泡发育受损是BPD的典型特征，但尚不清楚其具体的分子机制［1］。BPD 的病理过程包括氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。Kuwasako 等［2］于 1993 年从人体嗜铬细胞瘤中分离并提取肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM），ADM 是一种血管活性多肽。ADM 具有舒张血管、利尿、排钾、拮抗肾上腺素系统及抑制血管平滑肌细胞迁移增殖等生物学作用［3］。肺是合成和代谢ADM 的主要场所，主要由平滑肌细胞和内皮细胞分泌，随着缺氧时间的延长，内皮细胞的损伤逐渐增加，ADM 的含量逐渐减少［4］。ADM 主要通过降钙素受体样受体（calcitonin receptor-like receptor，CRLR）发挥作用，而受体活性修饰蛋白（receptor activity-modifying proteins，RAMP） 1、2、3 会改变 CRLR 的反应性和亲和力［5］。例如 CRLR/RAMP1 形成 CGRP-I 或 CGRP-II应答细胞；RAMP2 或RAMP3 与CRLR 共同表达时可激发ADM 的反应性［6］。有研究通过新生小鼠实验证明，小鼠生后14 d 左右ADM、CRLR 及RAMP2 的表达量最多［7］。细胞外信号调节激酶（extracellular regulated kinase，ERK）能将多种细胞外信号通过磷酸化转到核内，激活转录活化，参与细胞的生长发育、增殖分化、细胞凋亡及细胞形态的维持［7］。ADM主要通过ERK1/2信号途径诱导肺血管内皮细胞的增殖，并促进其生长和存活，进而改善肺部血管的生成［8］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号转导的关键介质，PKB 通过转导细胞外信号调控细胞增殖、迁移、抗凋亡和维持代谢稳态等过程［9-10］。Kim 等［11］通过实验发现，在内皮细胞的质膜上，ADM 与CRLR/RAMP2 或CRLR/RAMP3 受体结合，激活PKB 信号通路，进而促进内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成。

ERK/PKB 信号通路是 ADM 在 BPD 中发挥保护作用的关键通路，而ERK/PKB作为ADM通路下游的指标，在激活细胞增殖、减少氧化应激反应等过程中均发挥重要的调节作用，但具体的分子机制至今仍未完全阐明。假设ERK 和PKB 的表达受ADM 调控，就能深入了解ADM、ERK、PKB 在BPD 发生发展中的防御机制，为早产儿BPD 的防治提供新的理论依据及策略方向。故本研究旨在通过高氧暴露、沉默ADM 的表达探讨ERK 及PKB在人肺微血管内皮细胞（human pulmonary micro‐vascular endothelial cells，HPMEC）中的表达变化，为早产儿BPD 的发病机制与临床防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

HPMEC［8，12-14］由 美 国 模 式 培 养 物 集 存 库（American type culture collection，ATCC）提供，产品目录号：CRL-3244。ADM 小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和ADM 阴性对照siRNA 由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成。LipofectamineTM2000 购自美国 Life Technology 公司，TRIzol Reagent 购 自 美 国 Ambion 公 司 ，PrimeScriptTMRT reagent Kit （for real time） 及SYBR®Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus） 均购自日本TAKARA公司。

1.2 HPMEC高氧暴露模型的建立与实验分组

将HPMEC接种于50 mL培养瓶中，待HPMEC在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中生长至接近融合状态时，随机分为空气组和高氧组。空气组仍置于5%CO2培养箱中培养；高氧组将贴壁纯化后的细胞加入新培养液后置于3 L/min 92%O2+5%CO2高纯混合气中培养［15-17］，24 h后立即用封口胶密封培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，通氧前后观察细胞生长情况和形态变化，在培养结束时用CYS-1数字式测氧仪检测培养瓶中氧浓度，低于90%的标本弃去。

1.3 细胞转染

转染前24 h，在24 孔板中，每孔加入500 μL无抗完全培养基并接种0.5×105～2×105个细胞，待细胞融合度为80%～90%时进行转染。用250 μL无血清细胞培养基稀释1.5 μg 质粒DNA，轻轻吹吸3～5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250 μL无血清细胞培养基稀释5.0 μL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸3～5 次混匀，室温下静置5 min。混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3～5次混匀，室温下静置20 min。培养板上的细胞弃去培养基，加入不含血清和抗生素的DMEM 培养基500 μL，每孔细胞加上述500 μL 转染试剂和质粒DNA 混合液，轻轻摇晃混匀后，置于细胞培养箱37℃、5%CO2条件下培养4～6 h。取出培养板，小心吸去每孔液体后，加1 mL 新鲜的完全培养基，37℃、5%CO2条件下继续培养24～72 h。可在荧光显镜下观察和进行后续实验。

1.4 验证siRNA抑制ADM效果及可能机制

将细胞分为空白对照组、阴性对照组和ADM siRNA组，空白对照组未施加任何处理，阴性对照组和ADM siRNA 组细胞分别转染ADM 阴性对照siRNA 和 ADM siRNA 后，检测 ADM mRNA 及其蛋白的表达水平，观察siRNA对ADM的抑制效果。

将细胞分为未干扰组和干扰组，未干扰组未施加任何处理，干扰组细胞转染ADM siRNA 后，检测ADM、ERK1/2、PKB 的mRNA 及其蛋白表达水平。

1.5 RT-qPCR检测mRNA的表达水平

收集各组HPMEC，经不同的实验条件处理后，采用TRIzol 法根据说明书进行总RNA 的提取和鉴定。0.2 mL RNase free EP管中配制混合液，冰上操作。37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 60 min 得到的cDNA 加入180 μL ddH2O 稀释备用。可直接用于2nd-strand cDNA 的合成或PCR 扩增，-20℃保存。PCR 扩增时cDNA 的推荐最大使用量为原液1 μL。PCR管中配制PCR反应混合液，冰上操作。混匀，每个样品做3个重复对照。PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40～45个循环；解离曲线95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s；上机扩增检测。利用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成（表1）。实验独立重复3次。

表1 引物序列

1.6 Western blot法检测蛋白的表达

细胞蛋白抽提及定量、SDS-PAGE电泳、蛋白质转移、蛋白质显像均按照试剂操作说明书进行。新鲜配制封闭液：在TBST 中加入脱脂奶粉至终浓度为5%（w/v），封闭时，将膜浸入到封闭液中，室温下振荡1 h；加入稀释好的一抗抗体，4℃过夜；TBST洗膜3次（每次5 min）；加入稀释好的二抗抗体 （1∶5 000），室温1 h 振荡孵育；TBST 洗膜3次（每次5 min）。洗好膜以后，取出ECL发光试剂，取适量各溶液混合，将膜放入曝光仪器中，滴加发光液，曝光3次，每次5 min，选择3次曝光的重叠值。蛋白表达结果以目的蛋白与内参蛋白的比值表示。实验独立重复3次。

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料采用均值±标准差（）表示，两组间比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空气组和高氧组中ADM及其相关信号通路分子表达

与空气组相比，高氧组ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2、PKB 的mRNA 及其蛋白表达均显著上调，两组间表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2～3和图1。

图1 Western blot法检测空气组和高氧组蛋白表达电泳图

表2 空气组和高氧组ADM及其相关信号通路分子的mRNA表达比较 （）

表2 空气组和高氧组ADM及其相关信号通路分子的mRNA表达比较 （）

注：［ADM］肾上腺髓质素；［CRLR］降钙素受体样受体；［RAMP2］受体活性修饰蛋白2；［ERK］细胞外信号调节激酶；［PKB］蛋白激酶B。

images/BZ_99_237_2840_496_2903.pngPKB 1.02±0.15 1.43±0.32-3.489 0.003 3 3images/BZ_99_496_2840_642_2903.pngimages/BZ_99_642_2840_962_2903.pngimages/BZ_99_962_2840_1282_2903.pngimages/BZ_99_1282_2840_1602_2903.pngimages/BZ_99_1602_2840_1923_2903.pngimages/BZ_99_237_3021_496_3139.png空气组高氧组images/BZ_99_496_3021_642_3139.pngimages/BZ_99_642_3021_962_3139.png1.01±0.07 3.54±0.27images/BZ_99_962_3021_1282_3139.png1.00±0.05 1.91±0.21images/BZ_99_1282_3021_1602_3139.png1.00±0.09 2.47±0.17images/BZ_99_1602_3021_1923_3139.png1.03±0.05 3.38±0.38

表3 空气组和高氧组ADM及其相关信号通路分子的蛋白表达比较 （）

表3 空气组和高氧组ADM及其相关信号通路分子的蛋白表达比较 （）

注：［ADM］肾上腺髓质素；［CRLR］降钙素受体样受体；［RAMP2］受体活性修饰蛋白2；［ERK］细胞外信号调节激酶；［PKB］蛋白激酶B。

images/BZ_100_237_414_455_476.pngPKB 0.920±0.010 2.000±0.010-135.824＜0.001 3 3images/BZ_100_455_414_596_476.pngimages/BZ_100_596_414_926_476.pngimages/BZ_100_926_414_1255_476.pngimages/BZ_100_1255_414_1584_476.pngimages/BZ_100_1584_414_1914_476.pngimages/BZ_100_237_594_455_712.png空气组高氧组images/BZ_100_455_594_596_712.pngimages/BZ_100_596_594_926_712.png0.548±0.007 1.532±0.028images/BZ_100_926_594_1255_712.png0.728±0.008 0.948±0.007images/BZ_100_1255_594_1584_712.png0.308±0.007 0.469±0.008images/BZ_100_1584_594_1914_712.png0.248±0.007 0.757±0.007

2.2 空白对照组、阴性对照组、ADM siRNA 组ADM表达变化

空白对照组（1.026±0.067）、阴性对照组（1.082±0.090）、 ADM siRNA 组 （0.158±0.019）ADMmRNA 比较差异有统计学意义（F=561.702，P＜0.001）；空白对照组（1.088±0.091）、阴性对照组 （0.969±0.078）、 ADM siRNA 组 （0.554±0.069） ADM 蛋白比较差异有统计学意义（F=36.998，P＜0.001）。与空白对照组、阴性对照组相比，ADM siRNA 组ADMmRNA 及其蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）。见图2。

图2 Western blot 法检测空白对照组、阴性对照组、ADM siRNA组ADM 蛋白表达电泳图

2.3 未干扰组和干扰组ADM、ERK1/2 及PKB 表达变化

与未干扰组相比，干扰组ADM、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表达均明显下降（P＜0.05）。见表4～5和图3。

表4 未干扰组和干扰组ADM、ERK及PKB的mRNA表达比较 （）

表4 未干扰组和干扰组ADM、ERK及PKB的mRNA表达比较 （）

注：［ADM］肾上腺髓质素；［ERK］细胞外信号调节激酶；［PKB］蛋白激酶B。

1.00±0.07 0.47±0.09images/BZ_100_1284_1432_1469_1495.pngimages/BZ_100_1469_1432_1541_1495.pngimages/BZ_100_1541_1432_1775_1495.png3 3images/BZ_100_1775_1432_2009_1495.pngimages/BZ_100_2009_1432_2243_1495.pngimages/BZ_100_1284_1613_1469_1731.png未干扰组干扰组images/BZ_100_1469_1613_1541_1731.pngimages/BZ_100_1541_1613_1775_1731.png1.01±0.09 0.18±0.04images/BZ_100_1775_1613_2009_1731.png1.02±0.17 0.41±0.08images/BZ_100_2009_1613_2243_1731.png

表5 未干扰组和干扰组ADM、ERK及PKB的蛋白表达比较 （）

表5 未干扰组和干扰组ADM、ERK及PKB的蛋白表达比较 （）

注：［ADM］肾上腺髓质素；［ERK］细胞外信号调节激酶；［PKB］蛋白激酶B。

1.023±0.029 0.879±0.009images/BZ_100_1284_2043_1469_2105.pngimages/BZ_100_1469_2043_1541_2105.pngimages/BZ_100_1541_2043_1775_2105.png3 3images/BZ_100_1775_2043_2009_2105.pngimages/BZ_100_2009_2043_2243_2105.pngimages/BZ_100_1284_2223_1469_2341.png未干扰组干扰组images/BZ_100_1469_2223_1541_2341.pngimages/BZ_100_1541_2223_1775_2341.png2.118±0.007 0.907±0.006images/BZ_100_1775_2223_2009_2341.png0.559±0.009 0.507±0.006images/BZ_100_2009_2223_2243_2341.png

图3 Western blot 法检测未干扰组和干扰组ADM、ERK及PKB蛋白表达电泳图

3 讨论

随着现代医学的进步，氧疗已成为治疗早产儿的关键措施。氧气作为一种环境刺激，在肺的发育过程中发挥重要调节作用。但长期暴露于高氧环境会影响肺的发育，造成不可逆的损伤。目前BPD 发病率逐年增加。相关研究表明多种原因导致BPD的发生，但主要是活性氧（reactive oxy‐gen species，ROS） 和高氧环境的共同作用［18］，肺泡和肺部血管生长停滞是BPD 的主要特征［19］。Wang 等［18］指出患有 BPD 的早产儿预后较差，呼吸道感染的概率大且再次入院率高，视网膜病变、学习障碍和高血压的风险也相对较高；另外随着年龄的增长，肺功能会逐渐下降。

本研究以高氧暴露下HPMEC 为细胞模型研究对象，研究中选用高氧暴露作为诱导损伤，这与大多数住院早产儿生后需要氧疗相一致。目前永生化的肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelialtypeⅡcell，AECⅡ）尚未建立，原代培养的AECⅡ不稳定，并不适合进行基因转染。人类HPMEC 是从人类肺组织中分离的微血管内皮细胞，保留了内皮细胞的许多特征。内皮细胞可介导血液和组织之间的相互作用，在血管生成、血流调节、血管通透性、伤口愈合、炎症、动脉粥样硬化和转移中发挥重要作用［20］。因此本研究选择HPMEC为研究对象，其原因是：（1）其增殖和成熟在肺泡的形成及肺的生长过程中起重要作用；（2）其功能障碍与BPD 发病密切相关；（3）ADM 及其信号受体在动脉内皮细胞中表达丰富［8］。

RNA干扰是一种进化保守的过程，在转录后，特定基因的表达被一种siRNA抑制，siRNA识别互补mRNA 并诱导其降解。目前，RNA 干扰被广泛用于抑制特定基因的表达，以达到实验和治疗的目的。在本研究中，暴露在高氧环境中ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表达显著增加；用siRNA 抑制ADM 后，ERK1/2与PKB的mRNA及其蛋白表达均显著下降；由此推测ERK1/2、PKB 可能为ADM 信号通路下游靶点，共同参与BPD的保护过程。

在本细胞研究模型中，与空气组相比，高氧组 ADM、CRLR 及 RAMP2 的 mRNA 及其蛋白表达均显著上调；与未干扰组相比，干扰组ADM mRNA 及其蛋白表达均明显下降。ADM 主要通过CRLR发挥作用，而RAMP2可改变CRLR的反应性和亲和力［6］。类似地，Menon 等学者［8］分别于生后3、7、14、28 d 取空气呼吸（常氧）小鼠肺组织发现，ADM 在生后14 d 的表达水平最高；然后将1日龄的野生型小鼠随机分为两组，分别暴露在常氧或高氧中14 d，高氧组小鼠在空气中恢复14 d，恢复期后在生后28 d检测，发现高氧暴露小鼠的径向肺泡计数显著降低，平均线性截距显著升高，表明与常氧暴露小鼠相比，高氧暴露小鼠肺泡数量减少，直径增大。上述结果表明高氧可刺激ADM 的产生，并且ADM 的受体CRLR 和受体活性修饰蛋白RAMP2表达相应升高，提示ADM参与高氧诱导肺损伤的过程，并可能通过改善肺泡的形成在高氧肺损伤中发挥保护作用。

在本研究中，高氧组中ERK 的mRNA 及其蛋白表达均明显高于空气组；用siRNA 抑制ADM 表达后，ERK 的mRNA 及其蛋白表达均明显下降；ERK1/2与ADM的表达大致呈正相关。ERK级联反应是传递细胞外因子信号的中枢通路，调控细胞增殖、分化和细胞周期等过程［21］。类似地，Semplicini 等［22］发现 ADM 可刺激肾上腺球状带细胞中ERK1和ERK2的磷酸化、显著增加ERKs的活性，从而增强大鼠肾上腺球状带细胞的增殖。也有研究发现ADM 通过激活MAPK/ERK 下游信号通路，可能是由于转录调节因子Prospero相关同源异形盒蛋白1诱导CRLR基因的表达，直接促进内皮细胞的生长和生存［23］。在肾透明细胞腺癌细胞（786-0）转染ADM siRNA 后，ADM 的表达水平显著降低，且细胞增殖能力、体外迁移和侵袭能力均受抑制；ADM 可显著提高786-0 细胞内磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）水平，用不同浓度ADM 处理786-0细胞后，p-ERK1/2水平无显著差异，但当用ADM 受体拮抗剂（ADM22-52）或MAPK 抑制剂（PD98059） 阻断 ADM-ERK 通路时，p-ERK1/2 表达降低［24］。综上所述，在两种不同的实验条件下，ADM 与ERK 的表达趋势均一致，由此我们推测高氧可刺激ADM 的产生，ADM 靶向于ERK 信号通路，通过激活ERK1/2 后在高氧肺损伤中发挥保护作用。

在本研究中，暴露在高氧环境下，PKB 的mRNA 及其蛋白表达均升高，且PKB 与ADM 的表达大致呈正相关；与未干扰组相比，干扰组PKB的mRNA及其蛋白表达均明显下降。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）及其下游靶向激酶PKB 在调节细胞功能中发挥重要作用。PKB 通过磷酸化和调节其他激酶、转录因子和其他细胞内调节蛋白的功能来影响细胞的活性［25］。Nishimatsu 等［26］发现 ADM 以时间依赖和剂量依赖的方式诱导PKB 磷酸化，这种磷酸化是Ca2+/钙调蛋白通路介导的，而PI3K/PKB 通路在血管内皮中发挥维持血管张力、减少细胞凋亡及死亡、修复内皮和调节血管生成等多种生物学作用。但Gao等［24］发现用ADM 处理786-0 细胞后，磷酸化PKB水平未显著升高。大量研究表明转录因子核因子-E2 相关因子 2 （nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）/抗 氧 化 反 应 元 件 （antioxidant response element，ARE）是机体内重要的抗氧化信号通路，而PI3K/PKB 通路在Nrf2 的磷酸化过程中发挥重要作用［27-29］。由此推测Nrf2/ARE 信号通路可能参与ADM 保护高氧肺损伤的过程，但尚不清楚其具体机制。综上所述，PKB 与ADM 的表达大致呈正相关，我们由此推测高氧环境中会增加ADM的产生，而ADM 靶向于PKB 信号通路，通过激活PKB 后在BPD中发挥保护作用。

综上所述，高氧诱导BPD 的发生，ADM 是机体一种重要的活性肽，ERK/PKB 作为ADM 通路下游的靶点，ADM 可能通过调控CRLR/RAMP2 介导ERK/PKB 信号通路，在激活细胞增殖、减少氧化应激反应等过程中均发挥重要的调节作用，从而对BPD发挥保护作用。

本研究仍存在部分局限性，虽然ADM与ERK/PKB 信号通路存在正向调节作用，但我们尚未完全阐明其正向调控作用的具体机制，有待于进一步研究探讨。