基于网络药理学的丹参-葛根药对治疗2 型糖尿病作用机制研究

车 彪，王世东，陈小愚，李 娜，唐 诚

（北京中医药大学东直门医院肾病内分泌2 区，北京 100700）

2 型糖尿病（T2DM）是一种以慢性高血糖为主要表现的代谢性疾病。T2DM 发病率呈逐年上升趋势，根据国际糖尿病联盟（interational diabetes federation，IDF）统计，2013 年全球已有3.82 亿糖尿病患者，预计到2035 年，患者将增至5.92 亿［1］。长期血糖控制不佳会导致心、脑、肾、足等组织器官损害，引发诸多并发症。T2DM 严重威胁人类的生命健康，增加社会经济负担，因此防治糖尿病对人类的健康意义深远。中药复方在改善T2DM 症状、延缓并发症等方面具有一定优势，对中药复方的发掘与研究对防治T2DM 具有重要意义。著名名老中医祝谌予教授开近代活血化瘀法治疗T2DM 先河，丹参、葛根为其所创的代表性“活血对药”［2］。丹参养血活血、凉血化瘀，葛根生津止渴，舒筋活络，两药常用于治疗糖尿病及其并发症。然而，丹参、葛根治疗T2DM 的作用机制尚未完全明了，本研究应用网络药理方法，试对丹参、葛根治疗T2DM 作用机制进行研究，以揭示其科学内涵。

1 资料与方法

1.1 化学成分筛选及靶点预测

以丹参、葛根药对为研究对象，通过中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行化学成分的查询及筛选［3］，选取口服利用度（oral bioavailability，OB≥30% 且类药性（drug-likeness，DL≥0.18 的化学成分作为候选成分，并查阅相关文献资料对化学成分进行补充［4，5］。筛选结束后，在Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根据化学成分名称查询相应的SMILE 号，并导入Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.Swisstarget prediction.ch）进行靶点预测［6］。 在Unitprot 数据库（https：//www.Uniprot.org）中查询靶点的基因名，对靶点进行标准化处理。

1.2 T2DM 相关靶点筛选

以“type 2 diabetes mellitus”、“type 2 diabetes”等为关键词，筛选GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）、TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd）、DrugBank 数据库（https：//www.drugbank.ca）、Disgenet 数据库（https：//www. disgenet. org）中T2DM 的相关靶点。合并4 个疾病数据库靶点后，删除重复值作为疾病候选靶点。在Unitprot 数据库中查询靶点的基因名，对候选靶点进行标准化处理。

1.3 PPI 网络构建与关键靶点筛选

获取候选成分的相关靶点及T2DM 的候选靶点之后，对两者靶点取交集，并将交集靶点导入STRING11.0 数据库（https：//string-db.org）中，选择生物物种为homo sapiens（human），绘制蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）网络图［7］。通过Cytoscape 3.8.0 软件对交集靶点的PPI 网络进行拓扑分析，选择各节点连接度（degree）的2 倍中位数值、介度（betweenness）的中位数值及紧密度（closeness）的中位数值为最低阈值，对PPI 网络中靶点进行筛选。PPI 网络反映了靶点之间的相互作用关系，通过拓扑参数筛选后的靶点传递信息更高，影响节点更多，为PPI 网络中的关键靶点。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析

将2.3 中获取的关键靶点导入Metascape 平台（http：//metascape.org/gp/index.html），设置P＜0.01，选择生物过程、分子功能和细胞组分、生物学通路4 个模块，对关键靶点进行GO 功能及KEGG通路富集分析［8］，保存数据结果，并应用R 语言对数据进行可视化。

2 结果

2.1 化学成分筛选及靶点预测结果

从TCMSP 数据库并结合相关文献查阅初步提取丹参化学成分202 种，葛根化学成分50 种；根据OB≥30%、DL≥0.18 的要求，选定化学成分70 种，其中来源于丹参65 种，葛根5 种（表1）。将70 种化学成分导入SwissTargetPrediction 数据库中进行靶点预测，共得到化学成分靶点506 个。

表1 丹参、葛根药对化学成分Tab 1 Chemical constituents of Salvia miltiorrhiza（S. miltiorrhiza）and Pueraria lobata（P. lobata）

2.2 T2DM 相关靶点筛选结果

从GeneCards 数据库中筛选出T2DM 相关靶点1 298 个，TTD 数据库中筛选出T2DM 相关靶点10 个，DrugBank 数据库中筛选出T2DM 相关靶点34 个，Disgenet 数据中筛选出T2DM 相关靶点6 个，合并后删除重复值，最终得到1 328 个T2DM 相关靶点。

2.3 PPI 网络构建与关键靶点筛选结果

取化学成分靶点与T2DM 相关靶点交集，共得到219 个交集靶点。 将571 个交集靶点导入STRING 数据库，构建PPI 网络，结果见图1（A）。选取交集靶点PPI 网络中各节点连接度的2 倍中位数值（16）、介度的中位数值为（110.88）、紧密度的中位数值为（0.35）为最低阈值进行靶点筛选，共得到关键靶点51 个（见表2），对51 个关键靶点进行PPI网络构建，结果见图1（B）。51 个关键靶点归属于41 种化合物，包括丹参37 种，葛根4 种。

表2 丹参、葛根药对关键靶点Tab 2 S. miltiorrhiza and P. lobata key targets

图1 PPI 网络图Fig 1 PPI network diagram

2.4 GO 及KEGG 通路富集分析

为进一步阐明关键靶点的可能作用，应用Metascape 数据平台对关键靶点进行GO 及KEGG通路富集分析，共得到71 个细胞组分，85 个分子功能，559 个生物过程及137 条信号通路，使用R 语言对前20 条富集分析结果进行可视化，可视化结果见图2。由GO 分析结果可见，靶点基因涉及细胞膜筏、细胞膜微域、突触后膜等细胞组分（图2A）。在分子功能上（图2B）主要集中在蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶结合、胰岛素受体底物结合等功能，这些功能在生物过程上（图2C）可能与细胞对有机氮化合物的反应、细胞对氮化合物的反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞对激素刺激的反应等过程密切相关。KEGG 结果显示，关键靶点主要富集于AGE-RAGE 信号通路、P13K-Akt 信号通路、ErbB 信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1 等信号通路，见图2D、表3。

表3 关键靶点KEGG 通路富集结果Tab 3 Results of KEGG pathway enrichment analysis of key targets

图2 GO 与KEGG 通路富集分析气泡图Fig 2 Bubble diagram of GO and KEGG pathway enrichment analysis

2.5 成分-关键靶点-通路网络图

应用Cytoscape 3.8.0 软件对丹参、葛根药对预测的51 个靶点及相对应的41 种化学成分，以及靶点相对应的主要通路进行分析，构建核心药物组合成分-关键靶点-通路网络图，见图3。

图3 核心药物组合成分-关键靶点-通路网络图Fig 3 Diagram of core drug composition-key target-pathway network

3 讨论

丹参味苦，性微寒，可祛瘀生新，凉血消痈，《本草纲目》记载：“能破宿血，补新血”。葛根有生津止渴，舒筋活络之功，且其性味辛散，有助血液运行，如《本草经解》有言：“诸痹皆起于气血不流畅，葛根辛甘和散，气血活，诸痹自愈也。”丹参得葛根相助，其活血之力更强，适用于T2DM 内热伤阴且瘀血症状较为突出者。现代药理学表明葛根素联合丹参酮ⅡA 能减轻糖尿病大鼠微血管病变，抑制其炎症反应，且其配伍使用效果好于单药［9］。多项丹参、葛根联合治疗T2DM 的相关临床研究显示，丹参、葛根药对在改善T2DM 症状方面疗效显著［10，11］，这些均提示丹参、葛根药对在治疗T2DM 中的重要作用。

T2DM 发病机制复杂，且中药复方成分、靶点及通路众多，对丹参、葛根治疗T2DM 的作用机制尚未完全阐明。本研究通过网络药理学研究方法系统预测了丹参、葛根在治疗T2DM 的潜在化学成分、关键靶点、分子机制及相关通路。经过数据库检索，共筛选出70 种化学成分，51 个化学成分与疾病共同作用靶点，137 条潜在信号通路，这些结果都反映了丹参、葛根在治疗T2DM 过程中的潜在作用机制。

51 个关键靶点中，PIK3CA 连接度最高。研究表明，PIK3CA 可能与影响血管生成、细胞对葡萄糖刺激的反应及葡萄糖代谢过程相关［12］。PIK3CA 可激活参与细胞生长、存活、增殖、运动和形态的信号级联反应，从而发挥关键作用。除PIK3CA 外，MAPK3 及MAPK1 也与丹参、葛根多种化合物及靶点相关。MAPK3 和MAPK1 是在MAPK/ERK 级联中起重要作用的两个MAPK［13］，MAPK/ERK 通路在糖尿病及其并发症过程中起重要作用［14］。富集分析结果中，关键靶点主要富集于AGE-RAGE、P13K-Akt、ErbB、胰岛素抵抗、HIF-1 等信号通路。AGE-RAGE 信号通路是糖尿病微血管并发症形成与发展过程中的重要一环，现代研究表明，丹参酮ⅡA 能降低晚期糖化终末产物（AGEs）诱导下人肾小球系膜细胞的RAGE 表达及氧化应激水平，即通过阻断AGE-RAGE 信号通路起到抵抗糖尿病肾脏病进展的作用［15］。P13K-Akt 信号通路失调见于癌症、糖尿病、心血管疾病和神经疾病等多种疾病，其介导参与细胞社长发育的多个过程，ErbB 信号通路是P13K-Akt 的重要上游通路［16］。研究表明葛根素可上调P13K、AKT、AMPK、PPARγ 基因和蛋白表达，从而增加葡萄糖运转，改善胰岛素抵抗［17］。HIF-1 信号通路在血管再生、葡萄糖和能量代谢、细胞增殖等多个生物过程中起作用，Zhou 等［18］研究发现，丹参中丹酚酸B 可抑制血管新生，其机制可能与丹酚酸B 抑制HIF-1α、VEGF 表达有关。这些研究都提示了本研究预测的靶点及信号通路的可行性。

本研究通过网络药理学研究方法，对丹参、葛根药对治疗T2DM 的化学成分、靶点、通路之间进行研究，体现了丹参、葛根药对多成分、多靶点、多通路协同作用的特点。但丹参、葛根药对治疗T2DM 的作用机制仍有待后续动物或细胞试验的证实。