聚乙二醇化重组人干扰素α2b 位置异构体比例离子交换高效液相色谱测定法的建立及修饰位点分析

董世建，许培，章良弼，李增礼，程婷，王荣海，魏兆军

1.安徽安科生物工程（集团）股份有限公司，安徽合肥230088；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥230009

干扰素（interferon，IFN）是一类具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用的细胞因子［1］。聚乙二醇化重组人干扰素（PEGgylated-recombinant human interferon，PEG-rhIFN）是将重组人干扰素（recombinant human interferon，rhIFN）分子与聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）通过共价键链接形成的化学修饰蛋白药物。PEG-rhIFN 不仅保持了IFN 的抗病毒及免疫调节作用等生物活性，并增强了其理化及生物学稳定性，降低了免疫原性和毒性，显著延长了半衰期，每周仅需注射1 次，患者依从性更高。目前，国内已上市的PEG-rhIFN 产品有瑞士Roche 公司的派罗欣、美国Schering-Plough 公司的佩乐能及厦门特宝生物工程股份有限公司的派格宾，主要用于慢性病毒性肝炎的治疗［2-8］。

由于PEG 修饰后的蛋白与原型蛋白在质量属性方面存在较大差异，WTO 明确提出，与PEG 有关的质控项目（如修饰率、修饰位点、游离PEG 含量等）需重点关注［7］。另外，《生物技术药物研究开发和质量控制》中也明确规定，必须进行修饰位点确定和产品活性相关的理化指标的研究［9］。本课题组前期采用相对分子质量20 000 的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC）对 rhIFNα2b 进行修饰，修饰位点为其肽链上 α 或 ε 的氨基，所获得的 PEG-rhIFNα2b 与天然IFNα2b 氨基酸序列一致，由165 个氨基酸残基组成，理论相对分子质量为39 000，无糖基化修饰。IFNα2b 肽链中含有 10 个赖氨酸（K）残基（分别为K31、K49、K70、K83、K112、K121、K131、K133、K134和 K136）［10］，理论上，上述 10 个赖氨酸残基及 N-末端氨基酸残基均可与mPEG-SC 结合，由于修饰位点的位置是影响PEG-rhIFN 空间结构及生物学活性的关键因素，确定PEG 修饰位点及不同修饰位点异构体所占比例对PEG-rhIFNα2b 质量具有重要影响。因此，本实验建立PEG-rhIFNα2b 位置异构体比例的离子交换高效液相色谱（ion-exchange highperformance liquid chromatography，IEC-HPLC）测定法和质量标准，以期为PEG-rhIFNα2b 的质量控制提供保障。

1 材料与方法

1.1 样品 rhIFNα2b 原液（批号：Y20130125）及PEG-rhIFNα2b 原液（批号：20130222Y、20130227Y、20130306Y、20081224Y）由安徽安科生物工程（集团）股份有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 一水合柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠、柠檬酸三钠及二水合磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司；DTT 及IAA 购自美国Amresco公司；TFA 购自美国 Sigma 公司；Trypsin 购自瑞士Roche 公司；2-氨基乙基异丁烯酸购自美国AEM 公司；LC-10ATvP Plus 型高效液相色谱仪购自日本Shimadzu公司；Proteomix SCX-NP10（10.0 mm × 250 mm，10 μm）色谱柱购自苏州赛分科技有限公司；PROCISE491型蛋白质测序仪购自美国AB 公司。

1.3 色谱条件 采用Proteomix SCX-NP10（10.0 mm×250 mm，10 μm）色谱柱。流动相 A：1.8 mmol ／ L 一水合柠檬酸-3.3 mmol ／ L 十二水合磷酸氢二钠（pH 5.3），流动相 B：30 mmol／L 柠檬酸三钠-35 mmol／L二水合磷酸二氢钠（pH 6.0）；线性梯度洗脱：0 ~180 min：0%B → 12%B，180 ~ 220 min：12%B →15% B；流速：0.4 mL ／ min；柱温：25 ℃；进样量：不低于 100 μg。

1.4 方法的验证

1.4.1 专属性 分别取rhIFNα2b（批号：Y20130125）及 PEG-rhIFNα2b 原液（批号：20130222Y），超滤浓缩至终浓度约1 mg／mL，同时设空白对照（流动相A），按1.3 项色谱条件检测。

1.4.2 重复性 取PEG-rhIFNα2b 原液（批号：2013-0227Y），按 1.3 项色谱条件检测，每天测定3 次，连续测定3 d，记录主要色谱峰所占比例（面积归一化法），并计算相对标准偏差（RSD）。

1.5 质量标准的建立 取3 批PEG-rhIFNα2b 原液（批号为：20130222Y、20130227Y、20130306Y），按1.3 项色谱条件检测，每个样品平行测定3 次。应用SPSS 19.0 软件对测定结果进行分析，根据5 个位置异构体所占比例均值（n = 9）的95%可信限制定各位置异构体质控标准。

1.6 修饰位点分析 取PEG-rhIFNα2b 原液（批号：20081224Y），按1.3 项色谱条件进样，分别富集各位置异构体洗脱峰，委托蛋白质药物国家工程研究中心对各位置异构体进行Trypsin 酶解，再经15%SDS-PAGE 分离，收集 PEG 肽，通过 EDMAN 降解蛋白质N-末端氨基酸序列分析法［11］，采用蛋白质测序仪测定PEG 肽序列，并与理论肽进行匹配，对修饰位点进行分析。

2 结 果

2.1 方法的验证

2.1.1 专属性 空白对照与rhIFNα2b 原液无色谱峰出现，对PEG-rhIFNα2b 位置异构体比例测定无干扰；PEG-rhIFNα2b 可见5 个主要特征峰，按保留时间先后依次命名为峰 1、2、3、4、5，保留时间分别为106.198、146.598、158.598、178.598、192.598 min，各峰之间分离度分别为 5.166、1.288、1.903、1.016，分离度良好。见图1。表明方法具有良好的专属性。

图1 专属性的验证结果Fig.1 Verification for specificity

2.1.2 重复性 批号为20130227Y 的PEG-IFNα2b原液连续测定 3 d，峰 1、2、3、4 和 5 面积的总 RSD分别为1.96%、2.53%、2.54%、1.05%和1.86%，各峰面积日间RSD 分别为1.70%、2.21%、2.69%、0.65%、1.91%，均 < 3.0%，见表1。表明该方法具有良好的重复性。

表1 重复性验证结果（%）Tab.1 Verificatin for reproducibility（%）

2.2 质量标准 3 批 PEG-rhIFNα2b 原液（批号为：20130222Y、20130227Y、20130306Y）的 5 个主要位置异构体色谱峰所占面积百分比均值的95%可信限区间分别为5.757% ~ 8.058%、14.396% ~ 20.315%、7.850%~9.200%、30.904%~33.774%和31.362%~38.073%，见表2。经统计分析，5 个位置异构体色谱峰质量标准可拟定为：峰1 为5% ~ 9%、峰2 为14% ~ 21%、峰 3 为 7% ~ 10%、峰 4 为 30% ~ 34%、峰 5 为 31% ~ 39%。

表2 PEG-rhIFNα2b 位置异构体比例的测定结果（%）Tab.2 Determination of positional isomer ratio in PEG-rhIFNα2b（%）

2.3 修饰位点分析 确定PEG-rhIFNα2b 位置异构体峰1 修饰位点主要为K31，峰2 主要为K134，峰3主要为 K131 和 K164，峰 4 主要为 K83，峰 5 主要为K121，未检测到N-末端PEG 修饰。

3 讨 论

本研究采用PEG 修饰剂对rhIFNα2b 进行修饰，修饰位点为其肽链上的α 或ε 的氨基，理论修饰位点有11 个，所获修饰产物修饰位点的鉴定及不同修饰位点的位置异构体含量对该类产品质量控制至关重要。本研究建立了PEG-rhIFNα2b 中位置异构体峰含量的IEC-HPLC 测定法，该方法可分离出6 个位置异构体峰，在保留时间约为210 min 色谱峰峰面积较低，在空白对照图谱中，200 ~ 220 min基线存在一定波动，影响该色谱峰的含量测定，因此本研究对分离出的5 个主要位置异构体峰进行了研究，由于PEG-rhIFNα2b 的位置异构体性质非常接近，很难达到基线完全分离，会导致测定结果与实际结果存在一定误差，综合考虑方法本身的特点和其他影响因素（如不同色谱系统、不同厂家色谱柱等）可能造成的变异，应用SPSS 19.0 统计软件对多批原液主要位置异构体检测结果进行统计分析，5 个位置异构体色谱峰质量标准可拟定为：峰 1 为 5% ~ 9%、峰 2 为 14% ~ 21%、峰 3 为7% ~ 10%、峰 4 为 30% ~ 34%、峰 5 为 31% ~ 39%，该结果为该产品今后质量标准的制定提供了依据。另外，对5 个主要位置异构体杂质进行了收集，酶解每个位置异构体，对所获的酶解肽段进行N-末端测序，结果显示，位置异构体峰1 修饰位点主要为K31，峰 2 主要为 K134，峰 3 主要为 K131 和 K164，峰 4 主要为 K83，峰 5 主要为 K121，共推断出 6 个位置异构体的修饰位点，其他5 个理论修饰位点可能由于空间位阻的原因未发现PEG 修饰。位置异构体的分离与鉴定为今后开展不同修饰位点PEG-rhIFNα2b 的生物学活性和稳定性等质量研究奠定了基础。

对于非定点PEG 化修饰药物，不同修饰位点的位置异构体性质较接近，分离这些位置异构体需要根据其性质的微小差异，采用分辨率较高的分析方法。近年，毛细管电泳技术及超高效液相色谱技术快速发展，在PEG 化修饰药物质量研究方面应用较多［12-14］。另外，为了获取均一性高的修饰产物，采用定点修饰技术开发PEG 化药物也必将成为研究者的首选策略。在修饰位点鉴定方面，采用N-末端测序法对修饰位点进行鉴定首先要获取纯度较高的位置异构体杂质，若纯度较低易引起错误推断，随着高效液相色谱-质谱联用技术的发展，开发高分辨率质谱法鉴定和定量位置异构体也是今后的重点发展方向［15-16］。