制定疫苗生产过程中各类质量属性控制限的统计学方法分析

刘东梅，杨雯娜，肖雪莉，吕玉婷，高晶晶，赵一欢，杨淼，刘晨鸣，刘晓凡

兰州生物制品研究所有限责任公司质量保证部，甘肃兰州730046

统计过程控制限度是指示符合法规及注册要求的工艺操作范围与异常工艺操作范围的界限，通过历史操作数据计算获得，用于监测工艺的稳定性，若超出统计控制范围，则提示工艺性能漂移，与数值波动大小有关。快速发现偏离正常工艺操作范围有助于及时进行回顾，定期回顾能够加深对工艺的理解，并改进工艺。产品质量质控相关的质量标准、质量内控放行标准、趋势范围、警戒限、行动限等均属于统计控制限［1-3］。在疫苗生产的质量管理过程中，为确保产品安全有效及生产过程稳定受控，各类控制限的制定成为全面质量控制的重要因素。《药品生产质量管理规范（2010 年修订）》（简称《规范》）及其附录1 中规定，物料、中间产品、待包装产品和成品必须按照质量标准进行检查和检验，应制定适当的悬浮粒子和微生物监测警戒限和纠偏限［3］；《药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》中表明，制药企业用阈值法计算行动限和警戒限是一种常用方法，但《规范》中对计算产品质量标准及其他控制限度的统计学方法并未具体规定［4-5］。人用药品技术要求国际协调理事会（International Conference on Harmonization，ICH）要求，质量标准需结合生产工艺、中间品的稳定性、临床研究分析方法等因素进行建立，必要时还应对定量的数据进行统计分析，详尽叙述分析方法及其依据原理［6-7］。美国注射剂协会（Parenteral Drug Association，PDA）第 59 号技术报告表明，统计方法为持续生产符合预定质量标准的产品提供了客观证据，也可对工艺进行持续改进和开发，但文件中提供的过程控制统计方法不适用于非正态分布，非参数工具不在文件的讨论范围内［1-2］。

生物制品生产阶段需进行病毒滴度、活菌数、多糖分子大小等指标的检测，检测方法涉及动物检测，精度差异较大，易受主观因素影响。每种统计分析方法均具有自身的特点和局限，需满足一定的假设前提，在计算统计过程控制限时，应避免随意引用统计数字及套用各类公式［8-10］。本研究以A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗成品各质量属性的检测结果及其生产过程中产生的各数值型质量指标为例，对质量属性的检定结果按其分布类型进行分类统计分析，以期为疫苗生产中质量属性控制限的制定方法提供依据。

1 资料与方法

1.1 数据来源 2019 年生产的182 批A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗（每批包含2 个亚批）的关键质量属性的检测结果由兰州生物制品研究所有限责任公司提供，包括多糖含量（A 群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量）及水分指标。

1.2 统计学分析方法 个体分布识别提供14 种分布及Johnson 变换和Box-Cox 变换，用于寻找最佳的分布方式拟合数据及确定变换对数据拟合至正态分布是否有效，计算出每个分布和变换的Anderson-Darling 统计量及P 值，其过程中使用的似然比检验用以确定所选分布中添加一个额外参数对显著改善分布拟合的影响。

应用Minitab 数据统计分析软件，采用分布识别、正态概率检验、阈值法等统计分析方法对2019 年生产的A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量（A群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量）及水分的质量属性控制限的制定方法进行分类汇总，每个质量属性选择拟合度最高的4 个不同分布的概率图作为结果，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 A 群多糖磷含量

2.1.1 拟合优度检验 结合输出的P 和概率图，当选择分布为正态分布、Box-Cox 变换、对数正态、3 参数Weibull 时，差异无统计学意义（AD 分别为0.573、0.666、0.666、0.589，P 分别为 0.136、0.081、0.081、0.094），见表1；这些点均在拟合分布线附近分布，数据拟合良好，见图1。选择P 最大（0.136）的正态分布为其最优拟合分布。

图1 A 群多糖磷含量的概率图Fig.1 Probability plot of phosphorus content in group A polysaccharide

表1 A 群多糖磷含量的拟合优度检验及分布参数的极大似然估计Tab.1 Goodness of fit test of polysaccharide phosphorus content in group A and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.1.2 控制限制定 A 群多糖磷含量服从正态分布。单值图及移动极差图中均有检测结果违反判异准则1，即均有1 个点距离中心线超过3.00 个标准差，该点检测结果为 4.77 μg ／ 剂，在标准范围内（3.75 ~ 4.88 μg ／ 剂），见图 2。根据判稳准则（连续100 个点至多2 个点落在控制界限外）和判异准则，当前生产过程处于稳定状态。A 群多糖磷含量的工艺过程能力指数Cpk = 1.20，当前过程能力一般，可能与检测结果（4.77 μg ／ 剂）接近标准上限有关，见图3。因此A 群多糖磷含量的控制限应该在 μ ± 2σ（3.991，4.596）基础上适当延长作为其警戒限，在 μ ± 3σ（3.840，4.748）基础上适当延长作为其行动限。

图2 A 群多糖磷含量控制图Fig.2 I-MR control chart of phosphorus content in group A polysaccharide

图3 A 群多糖磷含量工艺能力指数报告Fig.3 Process capability index report of phosphorus content in group A polysaccharide

在疫苗的各阶段生产过程中产生的质量属性，若其结果服从正态分布，可按上述方法计算其警戒限和行动限等各控制限。

2.2 C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量

2.2.1 拟合优度检验 当选择分布为正态分布时，差异有统计学意义（AD = 0.866，P = 0.026），当选择的变换为 Box-Cox 变换、3 参数 Weibull、Johnson变换时，差异无统计学意义（AD 分别为0.703、0.621、0.462，P 分别为 0.066、0.067 和 0.257），见表 2；选择P 最大（0.257）的Johnson 变换为其最优的拟合变换，见图4。Johnson 变换函数为：-0.607 114 +1.792 75 × Ln［（X - 34.520 6）／（51.199 7 - X）］。

图4 C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量的概率图Fig.4 Probability plot of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

表2 C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量拟合优度检验及分布参数的极大似然估计Tab.2 Goodness of fit test of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.2.2 控制限制定 C 群多糖N-乙酰神经氨酸含量的检测结果按Johnson 变换时，差异无统计学意义（AD = 0.462，P = 0.257），数据服从正态分布。单值图及移动极差图中均有检测结果违反判异准则1，即均有1 个点距离中心线超过3.00 个标准差，该点检测结果为 39.1 μg ／ 剂，在标准范围内（37.5 ~ 48.8 μg ／ 剂），见图 5。根据判稳准则和判异准则，当前生产过程处于稳定状态，见图6。C 群多糖含量N-乙酰神经氨酸的标准范围经Johnson变换函数变换后，其上下限变为（-1.79，0.78），工艺过程能力指数Cpk = 0.37，工艺能力指数较低，这可能与个别批次接近标准下限有关，但从整体来看，C群多糖含量N-乙酰神经氨酸工艺能力保持相对稳定，过程处于稳定状态，见图7。基于以上两点，C 群多糖含量N-乙酰神经氨酸含量经Johnson变换后的数据应该在 μ ± 2σ（-1.445，1.431）基础上适当延长作为其警戒限，μ ± 3σ（-2.164，2.150）适当延长作为其行动限。

图5 C 群多糖N-乙酰神经氨酸的Johnson 变换Fig.5 Johnson transformation of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

图6 C 群多糖含量N-乙酰神经氨酸的控制图Fig.6 I-MR control chart of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

图7 C 群多糖含量N-乙酰神经氨酸的工艺能力指数报告Fig.7 A report on the process capability index of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

在疫苗的各阶段生产过程中产生的质量属性，若其结果服从非正态分布，可通过其分布拟合的情况计算其概率函数，再根据其分布规律制定相应的警戒限或行动限，最常见的变换有Johnson 转换和Box-Cox 变换。

2.3 水分 水分检测结果经分布拟合及数据变换差异有统计学意义（AD=3.444~125.048，P 均 <0.05），数据不能拟合任何一种分布，且不能执行Johnson 变换和Box-Cox 变换，见表3。选取P 最大的水分概率图（见图8），数据点并未沿着拟合分布线附近分布，离开直线，表明拟合是不可接受的。不考虑分布拟合情况，可使用公差限制法，即根据公差范围的95%或99%作为警戒限和行动限，当前水分的质量标准为< 3%，其警戒限可制定为<2.85%，行动限可制定为<2.97%。

图8 水分的概率图Fig.8 Probability plot of moisture

表3 水分拟合优度检验及分布参数的极大似然估计Tab.3 Test of moisture goodness of fit and maximum likelihood estimation of distribution parameters

在疫苗的各阶段生产过程中产生的质量属性，若其结果数据不能拟合任何分布时，可采用公差限制法或阈值法制定其控制限。

3 讨 论

统计方法在制药行业中具有重要作用，可确保持续生产符合预定质量标准。目前，ICH、PDA、欧洲联盟（European Union，EU）已有针对生物制药行业统计分析方法的指南，国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）也建立了一些通用的统计学分析方法指南，旨在帮助生产公司识别和正确使用统计学分析方法。合理的统计学分析方法可用于提高决策质量，是达到预期结果的一种手段。任何有意义的统计分析均有前提，首先，数据完整性应有保证，检测方法应可靠，分析方法获得合理的验证如分析方法应有充分的准确性、精密度、重复性、专属性、检测限及定量限［11］；其次，使用统计学工具需要满足一定的假设前提，如满足一定的统计分布特征（通常是正态）和取样的代表性［12-13］，否则用正确的公式计算出来的数字缺乏说服力。

本研究采用分布识别、正态概率检验及阈值法等统计学分析方法，以质量一致性良好的A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗成品各质量属性的检测为例［14］，讨论不同分布状态下质量属性检定结果制定控制限的方法，在疫苗各阶段生产过程中产生的质量属性，若服从正态分布，均可按照A 群多糖磷含量计算控制限的方法计算其警戒限和行动限等各类控制限，用以监控日常的生产是否处于稳定受控状态；对于服从非正态分布的质量属性，要通过其分布拟合的情况计算其概率函数，再根据其分布规律制定相应的警戒限或行动限，包括最常见的变换有Johnson 转换和Box-Cox 变换。对于不能拟合任何分布的质量属性，可利用阈值法或公差限制的方法制定其控制限度，阈值法是制药企业环境监测中规定行动限和警戒限常用的一个方法［3］，行动值的规定应符合GMP 的规定。无论使用哪种统计分析方法制定质量属性的控制限，当限度确立后，应定期进行产品质量回顾分析，以确认工艺稳定可靠及现行质量标准的适用性，及时发现不良趋势，若历史数据表明检测结果有异常趋势，则限度也应当进行相应调整以反映实际情况。使用合理的统计分析方法制定控制限后，其控制限的延长需结合《中国药典》三部（2020 版）［15］、注册标准及实际生产情况而决定。

采用科学规范的统计学分析方法制定疫苗生产过程中各类质量属性的控制限才具有合理性，才能对生产产生良好的指导意义。目前，本公司已按照本研究的方法制定了不同质量属性的控制限度，并才能对各批次产品关键质量属性检验结果进行动态I-MR 控制图趋势分析，以期及时发现过程中的异常情况并积极采取相应的预防措施，确保上市产品安全有效。