银-硅藻土纳米复合材料合成及抑制稻谷霉变研究

邢常瑞 孔志康 仲梦涵 汪 静 李 彭 袁 建

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

稻谷是世界上超过半数居民的主粮，是我国最重要的粮食作物之一[1]。我国近年来的粮食产量已大幅领先于世界其他国家，2013年我国水稻总产量达20 360 t[2]。新收获的粮食很大一部分需要进入粮仓储藏，陈粮流转进入流通市场。稻谷中的水分、脂肪酶及微生物的存在使得稻谷易于在不适储藏条件下发生霉变，引起品质劣变，影响粮食品质和安全[3]。因此，探索和应用新的纳米材料防止霉变，对提高储粮安全，延缓劣变和降低损耗具有重要意义。

稻谷储藏损失主要包括虫蚀、霉变和陈化等引起质量的损失。稻谷收获入仓后，群落演替，储藏过程中主要存在青霉、曲霉和镰刀菌等菌属，特别是曲霉可在低水分活度条件下大量繁殖，引起粮食变质[4, 5]。一项稻谷储藏损失统计表明，5年平均样本霉变率为3.53%[6]。稻谷霉变产生真菌毒素可极大降低稻谷的经济价值和食用价值。目前主要的稻谷防霉手段是通过入仓前的干燥灭菌和控制储藏环境，降低入仓前的微生物数量，控制微生物繁殖速度，防止稻谷质量劣变及产生毒素[7, 8]。银纳米粒子具有良好的广谱杀菌性，并且具有杀菌高效、无毒性、不产生耐药性等优点，被广泛应用于食品防腐、污水处理、医疗卫生等方面[9，10]。硅藻土具有毒性低、性质稳定、无残留及低成本的特点，被广泛应用于粮仓中害虫防治[11]。有学者研究发现硅藻土与植物精油复合增强其杀虫效果，与纳米银复合能够杀灭水中99.999%大肠杆菌、细菌及酵母[12]。目前，将纳米银材料或者其复合物用于稻谷实际储藏过程中防止真菌生长的案例不多，将其作为粮仓抑菌剂鲜有报道。

硅藻土已经广泛应用于粮仓中杀灭害虫，并且对粮食品质加工品质没有影响。本研究针对稻谷储藏过程中的防霉需求，合成一种Ag/PDDA-Diatomite纳米复合材料，具有简单、高效、安全、低成本的杀虫灭菌效果。对合成的银-硅藻土基本特性进行分析，测试其抑菌效果，探索应用该材料在稻谷储藏过程中的实际效果，为大规模推广应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粳稻(淮阴5号)。硝酸银、直链淀粉标准溶液，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JEM-200CX透射电子显微镜，TM3000扫描电子显微镜，JMWT12大米外观品质检测仪，7700x电感耦合等离子质谱仪。

1.3 方法

1.3.1 银-硅藻土纳米复合材料的合成

将0.14 g硝酸银(99.9%)加入100 mL去离子水中，搅拌溶解后加入0.21 g氢氧化钠沉淀硝酸银溶液，过滤去掉上清液后得到Ag2O沉淀物并溶解于100 mL质量分数为0.4%的氨水中，形成银氨络合物溶液；将银氨络合物溶液2倍梯度稀释后分别用氨水定容到100 mL，加入0.5 g葡萄糖，磁力搅拌30 min后，得到纳米Ag溶液。

将1 g干燥的硅藻土粉末分散在150 mL的0.01%PDDA溶液中，振荡2 h。然后使用S3孔隙率的烧结玻璃过滤器过滤PDDA-Diatomite，除去过量的PDDA，将PDDA-Diatomite用去离子水洗涤1 h，然后过滤。将1 g PDDA-Diatomite分别加入到100 mL不同浓度的纳米Ag溶液中并振荡2 h后，使用烧结玻璃过滤器过滤并用去离子水洗涤，合成物料比为85.0、42.5、21.25、10.63、5.3、2.65和1.33mg/g的Ag/PDDA-Diatomite，分别记为M-A、M-B、M-C、M-D、M-E、M-F、M-G。最后，将Ag/PDDA-Diatomite于80 ℃干燥2 h，并保存在干燥器中。

1.3.2 Ag/PDDA-Diatomite抑菌实验

选用稻谷储藏过程中常出现的产黄青霉、白曲霉、雪腐镰刀菌和黄曲霉来测试材料的抑菌性能。将分离纯化后的真菌分别接种至孟加拉红培养基上，在(28±1) ℃下培养5 d，取适量的无菌水将孢子洗至无菌锥形瓶中，振荡摇匀，用无菌纱布过滤除去菌丝体，4 000 r/min离心20 min后，用血球计数板计数，再用0.85%生理盐水将孢子悬液的浓度调至105～106CFU/mL摇匀备用。

在96孔板中初步测定不同合成物料比的Ag/PDDA-Diatomite的抑菌性，观察不同合成物料比的抑菌效果。称取1 g纳米复合材料溶于5 mL无菌水制备不同浓度的材料悬浮液；称取1 g纯硅藻土溶于5 mL无菌水，并进行2倍梯度连续稀释7次，制备纯硅藻土悬浮液，分别准备实验组、空白组和对照组，于(28±1)℃下培养，每24 h观察1次，实验进行3次。

实验组：100 μL马铃薯液体培养基，80 μL的不同浓度的纳米复合材料悬浮液和20 μL孢子悬浮液。

空白组：180 μL马铃薯液体培养基和20 μL孢子悬浮液。

对照组：100 μL马铃薯液体培养基，80 μL的不同浓度的硅藻土悬浮液和20 μL孢子悬浮液。

1.3.3 稻谷模拟储藏实验

将稻谷分为4组，每组称取1 000 g稻谷：第1组为空白组；第2组为对照组，添加800 mg硅藻土；第3组添加800 mg M-B；第4组添加800 mg M-C。混匀用塑封袋密封后，将这些稻谷放入相对应温度的人工气调箱中进行储藏，储藏温度为30 ℃，相对湿度恒定为60%，储藏时间为5个月，30 d为1个周期。

每个周期称取25 g的稻谷放入盛有225 mL无菌水的均质袋中，再用均质器均质3 min(30 r/min)，制成1∶10的菌悬液，吸取1 mL菌悬液进行10倍梯度稀释，制成4个稀释度的样品匀液，进行平板实验，于(28±1)℃培养5 d，记录菌落形态。观察菌落的形态特征和生长趋势，通过PCR扩增技术确定菌株种属。每个周期取出一定量的稻谷进行质量指标测定。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 真菌测定

真菌形态通过电子显微镜进行观察；真菌菌落总数参照GB 4789.15—2016测定真菌和酵母数量；真菌种类经DNA片段扩增后，通过阳性检测来判定。

1.4.2 大米感官品质测定

稻谷分样：参照GB/T 5494—2018对稻谷样品进行分样。

稻谷感官品质：参照GB/T 22504—2018测定。

1.4.3 大米化学品质测定

蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016凯氏定氮法。直链淀粉含量测定参照GB/T 15683—2008基准方法来测定。游离脂肪酸值含量测定参照GB 5510—2011苯提取法。稻谷糊化特性测定参照GB/T 24852—2010快速粘度仪法测定。Ag+含量的测定参照GB 5009.268—2016方法进行检测。

1.5 数据统计分析

每组实验重复3次，采用Matlab统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，通过Origin 8.5绘图。

2 结果

2.1 银硅藻土纳米复合材料的合成和表征

2.1.1 电位分析

硅藻土因表面有大量的羟基而带有负电荷，其电位为-(19.6±5.5)mV，而纳米Ag的电位为-(24.7±3.4)mV，所以硅藻土和纳米Ag无法相互结合。本实验通过阳离子聚电解质PDDA对硅藻土基质进行改性，使硅藻土负表面电位变为正表面电位(26.3±6.4)mV。具有正电位的PDDA-Diatomite可与负电位纳米Ag通过静电相互作用结合，得到Ag/PDDA-Diatomite[13]。

2.1.2 SEM和TEM表征分析

图1a表明，银颗粒表面形貌较为规则，粒子的大小平均为30～40 nm，无聚集现象。图1b是硅藻土的SEM图，可以看到硅藻土有较大的表面积、表面光整，孔结构丰富。图1c、图1d和图1e、图1f分别是Ag/PDDA-Diatomite的TEM和SEM图。可以看出硅藻土表面附着大量Ag纳米粒子，分布均匀，没有聚集现象。

注：a为Ag的TEM图；b为硅藻土的SEM图；c、d为Ag/PDDA-Diatomite的TEM图；e、f为Ag/PDDA-Diatomite的SEM图。图1 Ag、硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的TEM和SEM图

2.1.3 EDX元素分析

硅藻土的主要化学成分是SiO2，还含有少量金属氧化物。由表1和图2可知硅藻土含有C、O、Al、Si、Fe、Ag、Na、K这8种元素，其中Ag含量极少；图2中出现明显的Ag峰，说明在Ag/PDDA-Diatomite存在较多Ag。表1数据表明，纳米复合材料中Ag的原子质量分数由原来的0.04%上升到2.17%，证明了纳米Ag颗粒成功附着在硅藻土表面。

表1 硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite中各元素的原子质量分数

图2 Ag、硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的EDX元素表征分析图

2.1.4 X射线光电子能谱表征分析

硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的X射线光电子能谱(XPS)如图3所示。Ag/PDDA-Diatomite的Ag3d吸收峰是非常尖锐的2个峰(362～380 eV)，而硅藻土的XPS中没有Ag3d的2个峰，与EDX元素分析结果一致，Ag3d(368 eV)的出现，证明在PDDA-

图3 硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的XPS图(a) 和XPS Ag3d图(b)

Diatomite表面修饰上纳米Ag。从Ag/PDDA-Diatomite的Si2p(103 eV)、C1s(286 eV)和O1s(533 eV)证明硅藻土中依然存在，说明利用层层自组装方法成功合成Ag/PDDA-Diatomite，并且没有改变原有的化学键。

2.2 纳米复合材料在培养基环境中对真菌的抑制效果研究

2.2.1 纯硅藻土的抑菌效果

将经稀释后质量浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25和3.13 mg/mL的硅藻土悬浮液添加在培养基中，培养96 h后，4种真菌的菌落形态、大小和颜色以及菌丝的致密程度与空白组没有明显的变化，因此添加硅藻土悬浮液与否，不会影响4种霉菌的生长状态，即硅藻土没有抑菌活性，无法抑制4种真菌的生长。

2.2.2 Ag/PDDA-Diatomite的抑菌效果评价

将具有不同物料比的纳米复合材料(标记M-A、M-B、M-C、M-D、M-E、M-F和M-G)分别加入培养基中，经过96 h培养后，对不同真菌的抑制效果有所差异。

产黄青霉培养实验结果表明，培养24 h时，在M-E、M-F、M-G和空白组中出现菌落，菌丝白色致密。培养48 h时，菌落逐渐扩大，空白组中菌落明显大于实验组。培养72 h时，M-C中已经出现稀疏的菌丝，而M-D、M-E、M-F、M-G和空白组中的菌落直径进一步扩大，菌丝致密呈绒状。

白曲霉培养实验结果表明，培养24 h时，只在M-G和空白组中出现白色菌落，培养48 h时，在M-F、M-G和空白组中菌落大小无明显差距，在M-D和M-E组有白色绒状菌丝；培养72 h时，M-C组中出现稀疏的菌丝，而M-D、M-E、M-F、M-G和空白组中的菌落直径进一步扩大。

雪腐镰刀菌培养实验结果表明，培养24 h时，雪腐镰刀菌生长相对较慢，只在空白组出现很小的白色菌落，菌丝稀薄。培养48 h时，M-D、M-E、M-F、M-G和空白组中出现白色菌落，培养72 h时，菌落直径没有增加， M-C、M-D、M-E、M-F和M-G 5个实验组中都出现了菌落。

黄曲霉培养实验结果表明，培养24 h时，黄曲霉的生长速度相对最快，在M-D、M-E、M-F、M-G和空白组中出现黄色菌落，培养48～72 h时，黄曲霉的生长速度依然相对较快，M-C的孔壁四周开始生长菌落，另外4组实验组(M-D、M-E、M-F、M-G)和空白组中的黄曲真菌落颜色变深。

4种真菌的培养结果见表2，随着Ag/PDDA-Diatomite中银含量越高，对真菌的抑制作用越强。M-A、M-B可强烈抑制产黄青霉、白曲霉、雪腐镰刀菌和黄曲霉的生长，表2中不列出。M-C组结果表明，物料比为21.25 mg/g的Ag/PDDA-Diatomite只对产黄青霉、白曲霉有一定抑菌活性，对雪腐镰刀菌和黄曲霉的抑制作用相对较弱。物料比为10.63 mg/g及以下时，其对4种真菌的抑制作用不明显。综合成本、安全性和抑菌效果考虑，选用M-B和M-C组材料进行实际储藏实验。

表2 Ag/PDDA-Diatomite对四种真菌生长的影响

2.3 纳米复合材料在稻谷实际储藏过程中对真菌的抑制效果研究

稻谷的平板真菌计数结果如图4所示。空白组与对照组中真菌的增长速度快，增长趋势相一致。M-B和M-C组的真菌数量明显低于空白组与实验组，且增长趋势也明显较缓；与添加M-C的稻谷相比，添加M-B的稻谷中菌落总数略低。

图4 不同实验组中稻谷中菌落总数的统计

在稻谷储藏开始后，每月的取样结果如图5所示。在空白组与添加硅藻土对照组的培养基中有大量真菌，而M-C和M-B中菌落的种类和数量明显少于空白组和对照组，但仍然存在2种菌落(图4d中三角形内的菌落1和圆圈内的菌落2)。经过分离纯化后，进行形态学鉴定，见图5e和图5f。菌落1分生孢子梗较光滑呈不对称的帚状枝，其分生孢子梗有分支，顶端不形成膨大的顶囊。菌落2小型分生孢子数量较多，形态多变，大型的分生孢子数量少于小型分生孢子。基因测序鉴定菌落1和菌落2分别与产黄青霉(登录号：KF152942.1)、雪腐镰刀菌(登录号：LT841236.1)的基因相似性达到99%。

注：a 空白组；b 添加硅藻土组；c 添加M-C组；d 添加M-B组；e 菌落1形态学分析；f 菌落2形态学分析。图5 真菌平板培养结果

2.4 稻谷储藏过程中质量指标的变化

稻谷在储藏期间水分含量是影响稻谷质量指标的重要因素。水分降低会让稻谷在加工时更容易断裂，产生碎米。水分含量过高则适于稻谷中真菌的生长，真菌的大量繁殖会造成稻谷表面出现粉质现象使大米的完整率下降。

由表3可知，随着储藏时间的变化，稻谷不完善粒率总体呈现缓慢上升趋势，空白组的不完善粒率从2.23%增加到6.5%，添加Ag/PDDA-Diatomite稻谷的不完善粒率略低于同期空白组与对照组结果。稻谷在储藏过程中碎米率总体呈现快速上升趋势，空白组和对照组的碎米率由6%左右增加到21%，而添加Ag/PDDA-Diatomite的稻谷的碎米率略低于同期的空白组与对照组结果。4组稻谷整精米率下降了14%左右，添加Ag/PDDA-Diatomite实验组的整精米率略高于对照组和空白组的稻谷。总体而言，添加材料组与空白组相比，在不完善粒率，碎米率和整精米率3个指标上并无显著性差异。垩白是大米淀粉组织排列疏松而存在空气而导致白色不透明的现象，形成的原因主要是由于稻谷的品种和生长环境相关。稻谷储藏过程中，前期垩白度在6.7%左右，储藏5个月后不超过7.67%。4组稻谷的垩白度随着储藏实践延长没有明显的差异，表明添加材料对稻谷垩白无影响。

表3 稻谷储藏过程中质量指标变化

2.5 稻谷储藏过程中化学品质变化

稻谷储藏期间化学品质变化见图6。4组稻谷在储藏期间，蛋白质质量分数没有明显的变化，均在7%～8%，4组稻谷蛋白质含量也无明显差异。各组样品直链淀粉含量呈平缓增加趋势，空白组和添加硅藻土组的稻谷中直链淀粉质量分数从14.6%增加至18.9%；添加复合材料的2组稻谷的直链淀粉含量略低于空白组和对照组。4组稻谷在储藏期间，游离脂肪酸值增长较快，从最初的8 mg/100 g左右增加到22 mg/100 g左右，测定结果无显著性差异。储藏期间，4组稻谷糊化特性发生规律性变化，崩解值随着储藏时间增加而显著下降，添加纳米复合材料的两组稻谷的崩解值略高于空白组和对照组的稻谷。由此储藏发霉的稻谷的淀粉结构发生了一定的变化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂。回生值在储藏期间先上升后下降，峰值黏度随储藏时间增加而上升；4组稻谷的回生值和峰值黏度相互之间无显著性差异。由于复合材料中存在银离子，因此测定大米中Ag+含量可以监测银的迁移和释放。储藏期间，添加M-C和M-B的2组稻谷的米糠中Ag+的含量出现轻微的增加，而空白组和对照组稻谷的米糠中Ag+的含量在储藏过程保持稳定，测定结果表明4组稻谷中米糠和精米的Ag+含量都低于0.03 mg/kg，从这个结果可推断出Ag纳米粒子与硅藻土表面结合较为牢固。

3 讨论

在整个储藏期间，4组稻谷的菌落总数始终呈现上升的趋势。在稻谷实际储藏过程中，储藏期的前2个月，空白组和对照组稻谷的菌落总数上升的速度比较缓慢，在第3、4个月时，菌落数上升的相对较快，这可能与真菌的区系演替有关，稻谷表面的真菌由田间型真菌向仓储型真菌演变，而其中曲霉属真菌是导致稻谷霉变的重要真菌之一。平板培养结果表明，银硅藻土复合材料具有高效的抑菌效果。通

图6 稻谷储藏过程中化学品质变化

过PCR扩增技术确定产黄青霉和雪腐镰刀菌在稻谷储藏中受Ag/PDDA-Diatomite作用后还能少量存活，属于高耐受真菌。整精米率是评判大米感官品质的重要质量指标，有研究表明，粳稻米的蒸煮食味品质与其粒形特征显著相关，典型相关系数为0.764 3[14]。稻谷的多个指标，比如谷物颗粒大小、硬度、米糠层厚度、垩白度及蛋白含量都会对整精米率有一定影响。表3实验结果表明Ag/PDDA-Diatomite可以减缓整精米率的下降速度。储藏期间，4组稻谷的碎米率在第4个月时出现大幅度的上升，但在每个储藏周期，添加纳米复合材料的稻谷碎米率都低于对照组和空白组。这种情况可能是因为真菌的大量繁殖，大量干物质被消耗，并导致稻谷粉质和组织疏松，在加工时更易断裂，增加碎米率，降低整精米率。纳米银复合材料具有的抑菌作用减少了的真菌数量，减缓稻谷品质劣变、降低碎米率。

稻米直链淀粉含量和变化会影响稻谷蒸煮品质，引起米饭硬度上升，黏度下降。一般认为，相比于 4 ℃储藏，高温储藏会导致直链淀粉含量明显增加。在实际储藏过程中，直链淀粉增加可能是由于脱支酶活性高，将支链淀粉使其转变为直链淀粉片段，添加Ag/PDDA-Diatomite的2组稻谷(M-C和M-B组)其直链淀粉增加量要显著小于空白组和添加纯硅藻土组，有可能是材料中的银具有一定灭酶效果；也可能是由于空白组和对照组真菌大量生长繁殖导致稻谷本身温度高于添加材料组(M-C和M-B组)，而导致脱支酶活性高。

Ag/PDDA-Diatomite的稳定性对其抗菌性能的长期保持具有重要意义。在稻谷储藏过程中，添加M-B的2组稻谷的米糠中Ag含量在储藏的第2个月开始，银含量有少许增加现象，从0.016 mg/kg上升到0.026 mg/kg，说明添加的银硅藻土材料中有少许的银离子被黏附于稻壳上，在加工过程中迁移到米糠中。但总体来说米糠和精米粉中Ag的含量均小于0.03 mg/kg，米糠等副产物的加工利用未受到影响，大米食用安全品质也有保障。

4 结论

本研究验证了Ag/PDDA-Diatomite对稻谷常见真菌的抑制作用。结果表明Ag/PDDA-Diatomite中银离子含量越高，其对真菌的抑制效果越强。在培养基环境中，当物料比达到42.5 mg/g及以上时，能够对白曲霉、产黄青霉、雪腐镰刀菌和黄曲霉的生长产生强烈的抑制，同时真菌孢子也失去活性；Ag/PDDA-Diatomite可以实际应用于稻谷储存，高效抑制稻谷霉变。另外，该材料对大米品质的维持有一定作用，纳米Ag也不会影响大米食用安全性和副产物的加工利用。因此，银硅藻土纳米复合材料在稻谷仓储中具有很好的推广应用价值。