金花菌发酵对兰花香型漳平水仙茶的生化成分及抗氧化性的影响

许文璨，张恋芳，吴 双，陈文君，王文凤，王越悦，黄友谊，林细柳

（1.华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430070；2.福建省龙岩市农业农村局；3.龙岩市天淳茶叶研究所，福建 龙岩 364000）

漳平水仙茶产自福建省漳平市，外形为扁平四方块，分为兰花香型和桂花香型两种[1]，是唯一紧压的初加工乌龙茶[2]，其香气清高悠长，滋味浓醇鲜爽，深受闽西、厦门、广东和东南亚等地区消费者喜爱。金花菌是茯砖茶品质形成的关键微生物[3]，茶叶由金花菌发酵后降脂功能显著提升[4]，抑菌活性和抗氧化活性等也有所提高[5]。因其独特功能，金花菌已应用于发酵绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶等茶类[6]，开发出的新产品受到了人们的欢迎。当前漳平水仙茶的发展存在产品种类单一、竞争大、经济效益低等问题[7]，为此尝试以金花菌发酵兰花香型漳平水仙茶，为丰富漳平水仙茶产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种为华中农业大学茶学系茶叶加工与生物技术课题组从茯砖茶中筛选保存的优势金花菌（E.cristatumHT1）。市售兰花香型漳平水仙茶为2018年4月生产后放置一年多的产品。

儿茶素标品、没食子酸标品和咖啡碱标品，均为色谱纯，购于美国Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，甲酸为色谱纯购自天津市科密欧化学试剂有限公司、色谱纯甲醇购自 Thermo Fisher Scientific 公司，其它试剂均为分析纯，为国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 金花菌菌种的制备

以马铃薯培养基（Potato dextrose agar，PDA）接种培养金花菌，于28℃下恒温培养约一周。待金花菌的菌落上形成大量孢子粉时，将孢子粉刮落到无菌水中，振荡5min，以3000r/min离心5min，取上清液，得孢子悬浮液。经计数，稀释制成1×107cfu/mL孢子悬浮液。

1.3 金花漳平水仙茶的制备

取约20g兰花香型漳平水仙茶装入250mL发酵瓶，加入适量水，使茶叶含水量在40%左右，封口膜封口，以121℃高压蒸汽灭菌20min。待冷却后，每个发酵罐中加入2mL金花菌孢子悬浮液，混合均匀，然后置于28℃静置发酵7d，最后在40℃环境下烘干。设置不接菌的对照组，同时将对照组也放置在同样条件下一周，最后以40 ℃烘干。试验设置3个重复。

1.4 金花漳平水仙茶的生化成分测定

水分测定采用快速法（GB/T 8304-2013）。茶多酚测定为福林酚法（GB/T 8313-2018）。游离氨基酸总量测定为茚三酮显色法（GB/T8314-2013）。可溶性糖含量测定为蒽酮比色法[8]。水浸出物含量测定为减压抽滤法（GB/T8305-2013）。茶色素的测定为系统分析法[9]。

没食子酸、咖啡碱、儿茶素组分的测定采用高效液相色谱法（HPLC）：称取0.3g茶粉于10mL离心管，加入5mL于70℃水浴的70%甲醇溶液，混匀，超声波振荡15min，然后在4℃下浸提12h。滤液过0.45μm滤膜，然后上样进行HPLC测定。HPLC仪器型号：岛津高效液相仪，色谱柱为安捷伦TC-C18（250mm×4.60 mm×0.45μm）。流动相A为0.1%甲酸，流动相B为100%甲醇。采用梯度洗脱，流动相B的浓度为：0-10 min（10%-20%），10-35min（20%-45%），35-45min（45%-45%）。流速为0.5mL/min，进样量5μL，检测波长278nm[10]。

1.5 金花漳平水仙茶的抗氧化活性测定

将发酵后的漳平水仙茶用粉碎机磨碎并过40目筛，然后称取1.5g过筛茶粉，加入20mL沸蒸馏水于90℃水浴锅中水浴浸提30min，每15min摇一次。待冷却后，以3500r/min离心5min，将上清液以蒸馏水定容到25 mL容量瓶中，得待测样品液。

1.5.1 清除羟自由基能力的测定（hydroxyl radical scavenging activity，HSA）

依次取4mmol/L的水杨酸-无水乙醇、FeSO4溶液、H2O2溶液及稀释6倍的样品液各1mL于离心管中，于37℃水浴反应30min，以3600r/min离心5min得上清液，于510nm处测定吸光值AX、AX0和A0（AX为样品组吸光值；AX0为试剂空白吸光值，以蒸馏水代替H2O2；A0为样品空白吸光值，是以蒸馏水代替样品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[11]。

1.5.2 总抗氧化能力的测定（ferric reducing ability of plasma，FRAP）

取3mL FRAP至试管中，于37℃中水浴预热10min后，加入0.1mL的待测样品液，反应30min，然后将其取出冷却至室温，以蒸馏水为对照，于595nm处测定其吸光值X。以0.2-2mmol/L FeSO4标准溶液代替样品来测定，绘制标准曲线。标准曲线：C=0.4026*X+0.0008，R2=0.9993（C表示相当于硫酸亚铁的浓度，单位g/L）。计算1g茶相当于硫酸亚铁的mg量，单位%：M=C*25*d*10/m*m0（d为稀释倍数，m为茶叶质量，m0为茶叶干物质量）[12]。

1.5.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性测定（DPPH free radical scavenging activity，DSA）

取0.1mL茶汤和3.9mL的0.15mmol/L DPPH溶液于试管中混合均匀，室温避光条件下反应30min，于517nm测定吸光值AX、AX0和A0。（AX为样品组吸光值；AX0为试剂空白吸光值，以95%乙醇代替DPPH溶液；A0为样品空白吸光值，是以蒸馏水代替待测样品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[13]。

1.6 数据处理

数据经Excel 2019和SPSS 25处理，然后通过Origin 2019b软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 金花漳平水仙茶中水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖、没食子酸含量

经金花菌发酵后，兰花香型漳平水仙茶中水浸出物含量极显著性增加（p ＜0.01），增加了11.44%。这说明经过金花菌发酵，可以将漳平水仙茶中非水溶性大分子物质部分分解成水溶性小分子物质，从而增加了水浸出物含量，有利于提高茶汤的口感，使其更加醇厚。而游离氨基酸的含量极显著性降低（p＜0.01），降低了56.90%，这一结果与金花菌发酵绿茶[14]和金花菌发酵茶汤[15]的变化一致，可能与美拉德反应和金花菌在生长过程中利用氨基酸等相关[16]。

经过人工接种金花菌发酵后，兰花香型漳平水仙的可溶性糖含量与对照组相比略有增加，这一结果与金花菌发酵藤茶、白茶类似[17,18]，而没食子酸含量极显著性增加（p＜0.01），增加了182.71%，这与用金花菌发酵普洱茶（熟茶）的结果一致[19]。

2.2 金花漳平水仙茶中茶多酚和咖啡碱含量

由图1可知，经过金花菌发酵后，兰花香型漳平水仙的茶多酚含量与对照组相比极显著性降低（p＜0.01），降低了17.30%，可能是金花菌发酵使茶多酚氧化聚合[20]，这与金花菌发酵其它茶的结果类似[14,17,21-23]。茶多酚在茶叶中主要呈现涩的滋味特性[24]，经过金花菌发酵后含量显著降低，可见能在一定程度上降低茶叶的涩味，改善茶叶的口感。而发酵前后咖啡碱含量分别为27.33g/kg和27.36g/kg，几乎没有变化，这一结果与金花菌发酵铁观音的结果一致[20]，可能是金花菌难以分解利用咖啡碱[22]。

2.3 金花漳平水仙茶中儿茶素组分

如图2可知，漳平水仙茶经金花菌发酵后，没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）和表儿茶素（EC）等4种简单儿茶素极显著性增加（p＜0.01），分别增加了65.19%、80.23%、25.17%和77.49%，而表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和儿茶素没食子酸酯（CG）等4种酯型儿茶素极显著性降低（p＜0.01），分别降低63.07%、77.02%、63.10%和69.41%，应该是金花菌在发酵过程中产生的酶将酯型儿茶素水解成了简单儿茶素，而且酯型儿茶素是茶叶中重要的苦涩味物质[25]，可见金花菌发酵能降低茶叶的苦涩口感，有利于改善茶叶滋味。而邹金美等人[20]的研究也发现铁观音经过金花菌发酵后，EGC、CE和C显著性增加，而EGCG和ECG显著性降低。

2.4 金花漳平水仙茶中茶色素含量

茶色素是茶叶中具有生物活性的一类氧化聚合物，有一定的保健功能[26]。由图3可知，经过接种金花菌发酵，兰花香型漳平水仙的茶黄素含量与对照组相比极显著性降低（p＜0.01），降低了38.54%，这一结果与金花菌发酵绿茶类似[27]，而茶红素含量与对照组相比有所降低但并不显著（p＞0.05）。茶褐素有较高的生物学活性，其含量的增加使茶汤呈现褐色，同时它可能是发酵茶的主要呈味物质[14]。经过金花菌发酵后，兰花香型漳平水仙的茶褐素含量增加了13.92%。在金花菌发酵黑茶茶汤中，发现初期儿茶素被酶氧化为茶黄素，而茶黄素继续氧化聚合形成茶红素和茶褐素[28]。邹金美等[20]人用金花菌发酵铁观音发现，发酵茶中的茶红素和茶褐素含量均显著增加，而茶黄素减少。这些可能是金花菌在生长的过程中分泌了氧化酚类的酶，促使茶叶中的酚类物质氧化成茶黄素，然后使茶黄素继续氧化成茶红素和茶褐素[6,29]。

2.5 金花漳平水仙茶的抗氧化能力

2.5.1 清除羟自由基活性。由图4可知，兰花香型漳平水仙茶经过金花菌发酵后，其清除羟自由基能力有所提高，提高了12.84%（p＞0.05），这一结果与金花菌发酵普洱茶类似[4]。

2.5.2 总抗氧化活性。由图4可知，兰花香型漳平水仙经过人工接种金花菌发酵后，其总抗氧化活性与对照组相比极显著性增加（p＜0.01），增加123.30%，这一结果与金花菌发酵普洱茶和甜茶类似[4,30]。由此可见，人工接种金花菌发酵漳平水仙能有效提高茶叶的总抗氧化活性。

2.5.3 DPPH自由基清除活性。由图4可知，在DPPH自由基清除活性方面，接种金花菌的兰花香型漳平水仙与对照组相比，其清除活性极显著性降低（p＜0.01），降低了20.39%，这与陈皓睿等[15]用前期从六堡茶中筛选并鉴定的三株金花菌发酵茶叶和朱雯等[30]用金花菌发酵甜茶的结果类似。

2.6 金花漳平水仙茶中生化成分与抗氧化活性的相关性

为了解兰花香型漳平水仙茶中内含成分与抗氧化活性之间的关系，进一步进行了相关性分析。由图5可知，DPPH自由基清除活性（DSA）与茶多酚、CG、ECG和EGCG的含量呈显著正相关（p＜0.05），这与周琦等研究不同品种花茶的抗氧化能力的结果类似[31]，DSA与游离氨基酸、茶黄素和GCG的含量呈极显著正相关（p＜0.01），而与茶褐素和水浸出物的含量呈显著负相关（p＜0.05），与GA和四种简单儿茶素（C、EC、EGC和GC）呈极显著负相关（p＜0.01）。总抗氧化能力（FRAP）与四种酯型儿茶素（GCG、CG、ECG、EGCG）、茶多酚、游离氨基酸和茶黄素的含量呈极显著负相关（p＜0.01），Wang Z[32]等用七种茶源真菌发酵熟普时也发现，FRAP与茶多酚、GCG、CG、ECG呈极显著负相关（p＜0.01）。FRAP与水浸出物和C呈显著正相关（p＜0.05），与EC、GA、EGC和GC呈极显著正相关（p＜0.01）。清除羟自由基能力（HAS）仅与GCG呈极显著负相关（p＜0.01），与茶多酚、游离氨基酸、茶黄素、ECG和EGCG呈显著负相关（p＜0.05），与水浸出物含量呈极显著正相关（p＜0.01），与C、EC、GA、EGC和GC呈显著正相关（p＜0.05）。

3 小结

兰花香型漳平水仙经人工接种金花菌发酵后，其水浸出物、没食子酸和4种简单儿茶素（GC、EGC、C 和EC）等含量极显著性增加（p＜0.01），其可溶性糖含量无明显变化，其茶多酚、游离氨基酸、4种酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）和茶黄素含量极显著性降低（p＜0.01），咖啡碱和茶红素含量无显著性变化（p＞0.05），茶褐素含量有所增加。漳平水仙茶生化成分的变化影响其生物活性[6]，兰花香型漳平水仙接种金花菌发酵后，其总抗氧化活性极显著性增加（p＜0.01），而清除羟自由基能力略有增加，DPPH自由基清除活性极显著性降低（p＜0.01）。总之，漳平水仙经过金花菌发酵后，其有助于茶汤醇厚的水浸出物含量增加，具有苦涩味的茶多酚和酯型儿茶素含量降低，茶褐素增加，散发独特菌香[33]，且总抗氧化能力提高，由此可见，利用金花菌发酵漳平水仙茶能赋予漳平水仙新的风味，在一定程度上提高漳平水仙的品质和抗氧化活性，具有一定的开发前景。