智能有机纳米光敏剂的综合研究型实验设计*

吴风收，李浩兰，苏梦亚，李郭静

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205)

手术、化疗和放疗等传统疗法毒副作用大、易复发、治疗周期长[1-2]。近红外(NIR)光激活光疗法，如光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)，由于具有高效、微创等优点而受到广泛关注[3-5]。目前，大多数开发的光热剂都集中在无机材料上，如碳基纳米材料、金纳米棒和金属纳米结构[6-7]。然而，这些材料的不可生物降解性阻碍了其进一步的临床转化[8-10]。相比之下，具有良好生物相容性和可生物降解性能的有机光热剂具有更好的前景[11-12]。因此，探索近红外吸收强、高光热转换效率的有机光敏剂具有重要意义。

在此背景下，我们以1,6-二(三甲基乙炔基)芘和氟硼二吡咯为单元，设计并合成了一种基于具有D-A结构的共轭有机聚合物 (P-BDP)，通过纳米沉淀法将聚合物制备成纳米颗粒(P-BDP NPs)[13]。通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱、凝胶渗透色谱(GPC)等手段，对化合物中间体和聚合物进行结构及光物理性质表征。与聚合物P-BDP相比，P-BDP NPs 显示出更宽和红移的吸收光谱，最大吸收峰值在603 nm。在单次近红外激光(635 nm)照射下，P-BDP NPs可以同时产生光动力和光热效应，光热转换效率高达52%。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

试剂：氟硼二吡咯(NI-BDP)由本实验室前期合成并报道2，1,6-二(三甲基乙炔基)芘，N-碘代丁二酰亚胺(NIS)，三苯基膦，四三苯基膦钯(Pd(PPh3)4)，碘化亚铜(CuI)，三乙胺(TEA)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(MeOH)，四氢呋喃(THF)等试剂购自于伊诺凯化学试剂公司。实验仪器：IKA RET basic型油浴锅，R2010型旋转蒸发仪，METTLER ToLeDo ME104E型分析天平，Agilent 400MR核磁共振仪，TU-1901紫外-可见光谱仪，Fluoromax-4c-L荧光光谱仪，ZS90粒径仪，Bruker Auto MALDI-TOF 质谱仪。化合物的合成路线如图1所示。

图1 P-BDP的合成及其纳米颗粒P-BDP NPs的制备

1.2 NI-BDP的合成

在氮气气氛下，将2,4-二甲基吡咯(0.24 g, 2.50 mmol)、化合物6(0.47 mg, 1.00 mmol)溶解于120 mL干燥的二氯甲烷中，搅拌30 min后加入10 μLTFA做催化剂，于室温下搅拌6 h后，添加溶于30 mL DCM的DDQ(0.23 g, 1.00 mmol)，氧化3 h后，加入2.0 mL Et3N淬灭反应，搅拌15 min后加入2 mL BF3·Et2O，于室温下再搅拌3 h。真空除去溶剂，并将残余物用二氯甲烷和水萃取，有机相经无水Na2SO4干燥后减压浓缩。将所得残余物经柱层析分离，DCM作为洗脱剂。收集第二个荧光点，重复柱层析直至得到纯净的目标化合物，得橙黄色晶体(117 mg, 22.5%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8.67 (s,J=7.7 Hz, 2H, ArH), 8.18 (d,J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.75 (dd,J=18.1 Hz, 2H, ArH), 7.65 (d,J=7.9 Hz, 2H, ArH), 7.49 (d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 6.04 (s, 2H, CCHC), 4.46 (t,J=6.0 Hz, 2H, OCH2), 3.89～3.42 (m, 12H, OCH2), 2.57 (s, 6H, CH3), 1.54 (s, 6H, CH3), 1.16 (t,J=7.0 Hz, 3H, CH2CH3). MALDI-TOF MS: calcd for: 679.56, found: 679.30。

1.3 I-BDP的合成

将NI-BDP(100 mg, 0.15 mmol)与NIS(83 g, 0.45 mmol)一起溶解在15 mL无水DCM中。在30℃下搅拌0.5 h，TLC监测反应进程。用饱和的Na2SO3水溶液除去过量的NIS以防环境污染，并用DCM萃取。经无水Na2SO4干燥后减压浓缩，并通过柱色谱法纯化，洗脱剂为DCM。得紫红色固体结晶(125 mg, 90%)。表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8.67 (d,J=4.7 Hz, 2H, ArH), 8.17 (d,J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.73 (dd,J=35.7 Hz, 4H, ArH), 7.47 (d,J=7.3 Hz, 2H, ArH), 4.48 (d,J=4.9 Hz, 2H, OCH2), 3.93-3.38 (m, 12H, OCH2), 2.66 (s, 6H, CH3), 1.56 (s, 6H, CH3), 1.17 (dd,J=7.7 Hz, 3H, CH2CH3). MS (ESI):m/z=930 [M]+; 804 [M-I]+。

1.4 P-BDP的合成

将I-BDP(40.27 mg, 0.05 mmoL)、1,6-二乙炔基芘 (25.03 mg, 0.1 mmol)、Pd(PPh3)4(7 mg, 6 μmol)和CuI (1.50 mg, 8 μmol)和 MeOH/TEA混合溶液(24 mL)加入到 100 mL三口烧瓶中，在N2保护下升温至90 ℃回流搅拌72 h。反应完成后，减压浓缩，除去溶剂。用少量THF充分溶解固体，然后加入大量甲醇，直至溶液表面有少量漂浮物析出，静置以便析出更多固体。然后离心，倒掉溶液，留下固体，继续重复双溶剂重结晶操作，洗至离心出的溶液无色，然后干燥，得到蓝黑色固体P-BDP聚合物。

1.5 P-BDP纳米颗粒(P-BDP NPs)的制备

在超声处理下，将3 mL P-BDP (3 mg)的THF溶液滴入 30 mL去离子水中。随后，室温下鼓泡8 h去除THF，得到P-BDP NPs的澄清水溶液。

1.6 样品表征

使用核磁共振氢谱对化合物中间体确认分子的结构，使用凝胶渗透色谱系统确定P-BDP聚合物的分子量。利用ZS90粒径仪确定P-BDP纳米颗粒的尺寸和电位。利用TU-1901紫外-可见光谱仪和Fluoromax-4c-L荧光光谱仪来测定P-BDP NPs纳米颗粒的吸收光谱和发射光谱。

1.7 光热性能测试

在635 nm激光(1.5 W/cm2) 的照射下测量不同P-BDP NPs 溶液浓度(0、50、150和250 μg/mL)的温度升高情况。同时，在固定的P-BDP NPs浓度(200 μg/mL)下，以不同的功率密度(0.5、1.0和1.5 W/cm2)的635 nm激光进行照射，并记录溶液的升温情况。另外，我们通过5次加热和冷却循环实验探究了P-BDP NPs的光热稳定性，并通过相关公式计算P-BDP NPs的光热转换效率。水溶液的温度使用红外热像仪进行记录。纳米颗粒的光热转换效率由下式计算。

根据前述方法，由公式(1)测量光热转换效率(η)：

(1)

其中，h是传热系数；s是容器的表面积；hs的值由公式(2)确定；QDis代表由溶剂和容器介导的激光耗散的热量，值由等式(5)确定；I是激光功率；A是635 nm的吸光度。

(2)

其中，m是包含光敏材料的溶液的质量，C是溶液的比热容，τs是系统传热的时间常数，可以从等式(3)确定。

t=-τsln(θ)

(3)

其中，θ是无量纲参数，称为驱动力温度，使用公式(4)计算。

(4)

其中TMax和TSurr分别是最高稳态温度和环境温度。

(5)

1.8 光动力性能测试

以2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 作为活性氧(ROS)探针，测量 635 nm 激光照射后P-BDP NPs的ROS生成情况。DCFH-DA首先用氢氧化钠溶液处理转化为DCFH。随着激光照射时间的延长，记录P-BDP NPs和DCFH混合溶液从500到600 nm区间的荧光光谱变化情况。为了进行比较，使用未添加P-BDP NPs的DCFH 空白溶液作为对照。同时，以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为单线态氧(1O2)捕集剂，以亚甲基蓝(DMF和H2O的混合溶液中φΔ= 0.52)为商品化的光敏剂作为标准，测量635 nm激光照射下P-BDP NPs的1O2量子产量。具体地，实验最初加入50 μM DPBF，然后加入光敏剂(P-BDP NPs或亚甲基蓝)，将光敏剂的浓度调整到1 μM。分别用 635 nm 激光照射 0、30、60、90、120、150和180 s后测量DPBF的吸光度。根据公式(6)计算光敏剂的1O2量子产率。

(6)

2 结果与讨论

2.1 P-BDP的结构表征

P-BDP的凝胶渗透色谱(GPC)如图2所示，峰值分子量为2212，表明合成的P-BDP聚合物至少有两个分子单元，为低聚物有机分子。

图2 聚合物P-BDP的凝胶渗透色谱

2.2 有机纳米颗粒(P-BDP NPs)的粒径分析

如动态光散射(DLS)(图 3a)所示，P-BDP NPs的平均尺寸约为132 nm。因此，适当大小的P-BDP NPs 可能会通过高通透性和滞留(EPR)效应促进其被动积累到肿瘤部位。P-BDP NPs的zeta电位为+60.2 mV(图 3b)，因而可通过静电排斥作用增强粒子的稳定性，并降低被血清蛋白的吸附。

2.3 紫外吸收与荧光发射光谱

如图3c 所示，与I-BDP相比，P-BDP在二氯甲烷中显示出明显的红移和更宽吸收光谱，最大峰位于588 nm。在自组装成纳米颗粒后，P-BDP NPs在近红外区域的吸收红红移至603 nm，这可能是由于纳米结构中有机分子的π-π聚集造成的。从图3d中的荧光光谱可以看出，在488 nm激发下，P-BDP表现出明显的红光发射，而组装成纳米颗粒后，P-BDP NPs的荧光基本猝灭，这可能归因于分子间π-π聚集导致分子内电荷转移，能量以热量的形式耗散。

图3 (a) P-BDP NPs在水中的 DLS 尺寸分布；(b) P-BDP NPs在水中的 zeta 电位；(c) I-BDP、P-BDP和P-BDP NPs的吸收光谱；(d) P-BDP和P-BDP NPs的荧光光谱

2.4 光热性能分析

如图4a所示，P-BDP NPs溶液在激光照射下(635 nm， 1.5 W/cm2)发生显著的升温。例如，当P-BDP NPs为 250 μg/mL时，P-BDP NPs溶液在激光照射10 min后温度升高了21.3 ℃，而在相同的辐照条件下，纯水的温度仅升高了1.9 ℃，表明P-BDP NPs具有很高光热转换效率。此外，P-BDP NPs 溶液在激光照射下的升温情况显示出激光功率依赖性行为。如图4b所示，当采用0.5和1.5 W/cm2635 nm激光照射10 min后，P-BDP NPs溶液(20 μg/mL)的温度分别升高了8.3 ℃和21.3 ℃，表明激光功率密度越高，升温效果也越明显。图4c显示，P-BDP NPs溶液在激光照射前后其紫外吸收光谱无明显变化，表明其具有较好的光稳定性。通过测量 635 nm激光照射下和关闭激光后溶液的温度变化，来计算P-BDP NPs的光热转换效率(PCE)(图 4d)。根据冷却时间(t)与温度的负自然对数(-lnθ)的线性曲线来计算系统传热的时间常数(τ)，τ为348.9 s，如图4e所示。根据报道的方法和相关公式[]，计算出P-BDP NPs的PCE为52%。同时可以看出，经过五次加热和冷却循环后(图 4f)，P-BDP NPs溶液的温度变化并不明显，表明纳米光敏剂具有优异的光热稳定性。

图4 (a)激光辐照(635 nm，1.5 W/cm2)10 min，不同浓度的P-BDP NPs溶液的温升曲线； (b)不同功率密度(635 nm)激光辐照下250 μg/mL P-BDP NPs的温升曲线；(c) 辐照前后P-BDP NPs的吸收光谱(635 nm, 1.5 W/cm2, 10 min)；(d) 250 μg/mL P-BDP NPs在635 nm激光照射(1.5 W/cm2)下的光热效应，在没有照射的情况下冷却10 min；(e)冷却时间与温度的负自然对数之间的线性关系；(f) P-BDP NPs光热稳定性实验，采用五个交替的开/关激光照射周期(250 μg/mL，1.5 W/cm2)

2.5 光动力性能分析

活性氧探针DCFH-DA(2,7'-二氯荧光素二乙酸酯)可以被氢氧化钠溶液水解DCFH，继而被ROS氧化成绿色荧光发射的DCF[5]。如图5a所示，DCFH与P-BDP NPs混合后的荧光强度随着光照时间的延长而增强，而未加入P-BDP NPs的对照组在相同条件下没有表现出明显变化，表明P-BDP NPs在激光照射后可诱导ROS的生成。单线态氧(1O2)是ROS最主要的一种。以1,3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF) 为捕集剂，亚甲基蓝为参比，测定了激光照射下P-BDP和P-BDP NPs的1O2量子产率。如图5b所示，在激光照射下，在P-BDP或P-BDP NPs存在下，DPBF的吸光度显示出时间依赖性降低，同时可观察到P-BDP NPs下降趋势与P-BDP相当，说明经纳米沉淀法组装成纳米颗粒后，其单线态氧产率无明显变化。

图5 (a) 随着光照时间的延长，DCFH在525 nm处的荧光强度变化情况；(b) 在P-BDP NPs存在下DPBF 在414 nm处的吸收强度变化随着光照时间延长的函数

3 教学效果与反思

(1)本实验围绕肿瘤的光学治疗这一重要科学问题而提出，内容紧密联系实际，主题接近生活，易于激发学生的学习和科研兴趣。学生通过查询相关科研文献，对肿瘤的治疗方案有一定认识后，可以开始着手此项实验的开展。本实验可以让学生认识和理解有机化合物的合成方法及纳米材料的结构性能。学生通过本实验的科研训练后，不但可以拓宽知识面，提升自己的实验操作技能，还能领悟科学研究的思路和方法，为今后的科研工作打下坚实基础。

(2)教师在指导学生开展此项研究工作时，要注重文献讲解和实验操作解析相结合。通过启发式教育，引导学生进行深入的思考，让学生在实验操作中领悟各个实验环节的原理，让学生不但要知其然，还要知其所以然，培养学生的创新意识和理念。当实验结束时，要求学生进行实验总结，并对各项实验结果进行反思。同时，组织学生进行讨论，分享各自成功和失败的经验，对一些有建设性的成功经验和创新性想法进行汇总。对本研究主题感兴趣的同学可以加入教师的课题组自行提出实验方案，在与指导教师充分讨论后可以独立开展相关课题实验。

4 结 语

本文以氟硼二吡咯为核心，设计并合成了具有D-A结构的共轭聚合物分子(P-BDP)及其纳米颗粒。P-BDP在近红外区域表现出有效的吸收和较强的荧光。在自组装成纳米颗粒后，P-BDP NPs 的吸收进一步红移，最大峰值在603 nm处。在635 nm激光照射下，P-BDP NPs可以同时产生活性氧和光热效应。经计算，P-BDP NPs的光热转换效率高达52%。本实验涵盖了有机光敏剂的合成及光谱解析、纳米颗粒的制备和表征、纳米颗粒的光热及光动力性质测试及分析等知识点，有利于培养学生的科学思维和创新实践能力。