硝基还原酶制备及检测*

安亚萱，韩 蕊，王凯悦，王玉彬，毛淑红，刘 凯，朱柏林

(1天津师范大学化学学院，天津 300387；2天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

硝基还原酶(NTR)广泛存在于哺乳动物、细菌和真核生物中，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，NADPH)存在下，能催化还原多种含硝基芳香化合物，实现生物体硝基芳香化合物代谢和环境中芳香族硝基化合物的生物降解[1-2]。生物体内NTR 与细胞缺氧环境有密切关系，细胞缺氧通常会导致细胞内NTR含量增加。缺氧是恶性肿瘤产生过程中普遍存在现象，通过检测 NTR 的变化可实现对生物体肿瘤细胞发展状况的监测，对临床治疗具有重要意义。因此，NTR检测具有重要意义[3-4]。

高活性硝基还原酶制备是NTR荧光探针性能研究的前提，目前，商购NTR存在活性不高问题。本文优化了NTR制备方法，获得了高活性NTR；合成了NTR荧光探针1，研究探针1与NTR作用。实验结果表明，荧光探针1对NTR是敏感的，随NTR含量增大，探针荧光强度增大，并呈现良好的线性关系。本工作为NTR制备及其荧光探针研究提供了有益的素材。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

FS5荧光分光光度计，Edinburgh仪器公司；核磁波谱仪(400M Hz)，Buker公司。

菌株E.coliK12，E.coliBL21和质粒pET28a于天津科技大学应用微生物与酶工程实验室保存；NADH购自Sigma Chemical；2,4-二甲基吡咯、3,4-二硝基苯甲酸等化学试剂均为中国化学试剂有限公司生产的分析级化学试剂。

1.2 硝基还原酶NfsB目的基因的扩增

1.2.1 PCR扩增

按照NCBI中E.coliK12菌株中，NfsB的基因序列，将引物的序列设计如下：

NfsB-Forward：GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG

NfsB-Reverse：GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT

以NfsB-F和NfsB-R为引物，利用PCR将目的基因扩增。在扩增产物的5′末端添加限制性内切酶EcoRI的酶切位点，在扩增产物的3′末端添加限制性内切酶NdeI的酶切位点。之后利用电泳检测并对PCR产物进行回收。

1.2.2 表达载体的构建

本实验采用EcoRI和NdeI两种酶对载体质粒和PCR产物进行双酶切，具体酶切体系如表1所示。酶切结束后，根据目的基因和载体质粒摩尔比为2:1于16 ℃过夜连接，如图表2所示。

表1 载体质粒双酶切体系

表2 双酶切片段连接体系

1.3 基因工程菌株的构建

1.3.1 E.coli DH 5α感受态细胞制备及目的基因转化

将混合好质粒和感受态细胞冰浴20 min后，在42 ℃进行90 s热激，再进行2 min的冰浴。添加500 μL不含抗生素LB培养基，37 ℃环境中进行1 h的培养。离心后取适量菌液涂布平板，37 ℃过夜培养。将经PCR验证转化成功的转化子接种到LB液体培养基中，于37 ℃恒温摇床中进行过夜培养，之后进行质粒提取，并通过酶切验证。

1.3.2 NfsB的诱导表达

取10 mL种子培养液，按2%接种规格，将其转接到30 mL LB液体培养基中，添加200 μL卡那霉素，调节培养液浓度为 60 μg/mL，于37 ℃培养3 h，添加20 μL 2 M IPTG溶液，之后将溶液置于16 ℃的恒温培养箱中，进行诱导表达。

1.4 NfsB的分离纯化

培养结束后，将培养液于4 ℃ 8000 r/min离心10 min，去上清，加入30 mL细胞裂解缓冲液，对菌体细胞进行重悬。加300 μL溶菌酶后，进行菌体超声破碎，于4 ℃ 12000 r/min离心30 min。采用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化，并通过SDS-PAGE对目的蛋白进行验证。

1.5 NTR浓度测定及酶活检测

利用Brandford法测定蛋白浓度。基于NADH在340 nm波长处吸光度变化来测量NTR还原活力[1]。

图1 探针1的合成路线

1.6 氟硼吡咯探针的制备

Ar保护下，取3,4-二硝基苯甲酰氯(2.3 g，10 mmol)和2,4-二硝基吡咯(1.90 g，20 mmol)于三口烧瓶，室温反应3天，反应体系颜色为生深红色。加入5 mL无水三乙胺15 min后，再加6 mL 47%三氟化硼乙醚，继续反应1天，猝灭反应，萃取，减压蒸除有机溶剂，经柱色谱分离得红色探针1(1.55 g， 40%)[5]。1H NMR(400 MHz，CDCl3) δ:1.43 (s, 6H，-CH3), 2.57 (s, 6H，-CH3), 6.06(s, 2H，pyrrole-H), 7.75-8.15 (m, 3H，Ar-H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:14.9, 15.4, 122.4, 125.5, 126.1, 130.5, 133.4, 134.8, 141.8, 142.1, 142.3, 143.6, 157.8. FAB-MS:found 415.82, calcd for[M+H]+, 415.14。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒NfsB-pET28a构建

根据目的基因序列和酶切位点要求，按照引物设计原则分别构建了引物NfsB-pET28a-F和NfsB-pET28a-R。在实验中，以硝基还原酶NfsB目的基因为模板，以pET28a质粒为目标载体，利用PCR对目的基因进行扩增。在扩增产物3′末端载入限制性核酸内切酶EcoR I酶切位点，在扩增产物的5′末端载入内切酶Nde I酶切位点。

对PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，结果如图2(a)所示。PCR条带与NCBI检索的目的基因大小(654 bp)一致[6]。载体酶切验证如图2(b)显示，pET28a基因大小为5369 bp，表明酶切正确。之后的菌群PCR验证证明菌体PCR验证条带是正确条带(图2(c))。上述实验结果说明，重组质粒NfsB-pET28a构建完成目的基因片段正确，可用于下一步实验。

图2 (a)NfsB基因的PCR结果(M：10KB标准DNA；1-2：NfsB基因)；(b)pET28a载体酶切图(M：10KB标准DNA；1-2：pET28a基因)；(c)菌群PCR验证(M：10KB标准DNA；1：转化子PCR验证)

2.2 NTR的表达与纯化

重组NfsB转化到大肠杆菌BL21细胞中，经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测蛋白的表达，如图3所示，在分子量大约为23 kDa的地方能观测到一明显的诱导条带，与NCBI中检索得到的蛋白分子量23.9059 kDa结果一[7]；通过Brandford法测定蛋白浓度9.549 mg/mL，与文献查阅所得基本一致[7]。实验结果表明，蛋白表达量浓度纯度相对较高，已获得了目标蛋白，可作为标品用于下一步NTR荧光探针性能表征。

M-标准蛋白Marker;1-上清蛋白样;2-沉淀蛋白样;3-流出液蛋白样;4-wash buffer蛋白样;5-加入wash buffer后树脂吸附蛋白样;6-洗脱液蛋白样;7-加入洗脱液后树脂吸附蛋白样

2.3 NTR酶活分析

NADH存在下，利用NTR催化还原对硝基苯酚为对氨基苯酚测定其酶活，是NTR活性检测的重要方法之一[1]。配置不同浓度NADH(0～0.16 mM)于PBS缓冲液中，加入适量NTR和对硝基苯酚。于37 ℃下，测定340 nm吸光度。据此拟合得到NADH消耗量与吸光度之间关系，即A=3.406[NADH]+ 0.0714 (R2=0.998)，如图4所示，据此可计算出体系每反应100 μL NTR消耗0.008 mM的NADH。根据酶活计算公式：

图4 NADH的标准曲线

U=(D×EW×V×103)/(6220×l×Vs)

其中：D为稀释倍数，EW为1 min内340 nm处吸光值的变化；V为反应液的体积(mL)；6220为摩尔消光系数 (L mol-1cm-1)；L为光程距离(cm)，Vs为酶液体积。

可得酶活U=163.34 U/mL[8]。

2.4 探针1与NTR含量关系

研究中固定探针1浓度为3×10-5M、改变NTR浓度(0～ 3 μg/mL)，于37 ℃ pH=7.4 PBS缓冲液中测定其520 nm荧光强度。如图5所示，随NTR含量增加，荧光强度逐渐增大；在NTR浓度范围为0.2～2.0 μg/mL，荧光强度与其呈现较好的线性关系，据3σ/slop[9]可确定其检测限为15 ng/mL。

图5 化合物1荧光强度和NTR含量关系

3 结 论

本文通过基因工程菌制备并纯化NTR，利用其对对硝基苯酚催化还原能力确定了NTR活性。结合氟硼吡咯类荧光探针研究，构建了可被NTR还原的含双硝基的氟硼吡咯化合物1，考察了识别过程中荧光强度与NTR含量关系，随NTR含量增大，荧光强度增强，其数值与NTR含量具有较好的线性关系。实验结果表明，化合物1可作为NTR探针使用，本工作为NTR识别与传感研究提供了有益素材。