胃肠胰神经内分泌肿瘤中miR-124和Capn4的水平及其与化疗敏感性及预后

杨玮蔚

（郑州第二人民医院，河南 郑州 450006）

胃肠胰腺神经内分泌肿瘤（GEP-NENs）为发生在胃肠道和胰腺中的罕见疾病，并表现出与常规胃肠道胰腺上皮癌不同的组织病理学特征。随着胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤的治疗和管理的不断进步，患者的临床症状可以得到很快改善，但是，该肿瘤的预后仍然很差，其5 年总生存率较低。特别是对于不能通过外科手术切除的晚期和复发性肿瘤，放化疗是治疗的主要方法，但是临床效果仍然有限［1］。因此，临床上寻找治疗胃肠胰神经内分泌肿瘤的靶点及预后判断标志物非常重要。miR-124 是一种单链非编码RNA 分子，在肿瘤发生中参与并控制基因表达和细胞生物学行为［2］。研究［3］显示，miR-124 低表达与胃癌、乳腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤和鼻咽癌在内的多种肿瘤发生和进展有关。钙蛋白酶小亚基1（calpain small subunit 1,Capn4）是钙蛋白酶的调节亚基，参与肿瘤细胞迁移，侵袭，增殖，分化和凋亡等生物学行为，已发现Capn4 在鼻咽癌、透明细胞肾细胞癌和肝内胆管癌中过表达，并与肿瘤的发生进展及预后相关［4］。研究［5］显示，Capn4可能是miR-124 的靶基因，miR-124 通过负调控Capn4 调控肿瘤发生发展的病理过程。本研究采用定量反转录PCR（qRT-PCR）技术检测癌组织及癌旁组织中miR-124、Capn4 mRNA 表达情况，免疫组化检测Capn4 的蛋白表达，分析胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤组织miR-124、Capn4 表达水平与化疗敏感性和预后的相关性，为胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤的临床治疗及预后诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009 年1 月至2015 年1 月郑州第二人民医院收治的91 例胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤患者。纳入标准：①首次接受手术治疗；②未接受化疗和放疗；③患者均知情并签署知情同意书，并经郑州第二人民医院伦理委员会的批准。排除标准：①合并其他肿瘤疾病的患者；②伴有心、肝、肾等器官疾病的患者；③自身免疫性疾病。其中男79 例，女12 例；年龄36～84 岁，平均（61.38±7.53）岁；肿瘤位置：胃31 例，小肠24例，结肠17 例，胰腺19 例；TNM 分期，T1～T2期48 例，T3～T4 期43 例；分化程度分类：高分化46 例，中低分化45 例；发生淋巴结转移41例，未发生淋巴结转移50 例。收集91 例胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤患者癌组织及癌旁组织（距癌灶>3 cm 以上），并将组织置于液氮中保存。

1.2 主要试剂和仪器

UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit（南京建成生物研究所）；兔抗人Capn4 多克隆抗体（美国proteintech 公司），稀释浓度1∶50；二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒（南京建成生物研究所）；LightCycler®96 全自动荧光定量PCR 仪［罗氏诊断产品（上海）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 检测miR-124、Capn4 mRNA 的表达 Trizol 提取组织中总RNA，逆转录试剂盒反转录生成cDNA。采用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit（2×），选取2 μL cDNA 于20 μL 反应体系行qRT-PCR。循环条件：94℃2 min；95℃15 s，60℃25 s，60℃30 s，共40 个循环。以GAPDH作为内参基因，引物序列由上海铂尚生物科技有限公司提供。miR-124 上游序列：5´-TTAGAGGCT CTGCTCTCCGT-3´，下 游：5´-TTCACCGCGTGCC TTAATTG-3´，产物大小70 bp；Capn4 上游引物：5′-TGGAACCGACTCCCAGAACT-3′，下游：5′-G GCCGAGACTTCACGGTTT-3′，长度122 bp。内参GAPDH 上游序列 ：5′-GGATTTGGTCGTA TTGGGCG-3′，下游序列：5′-TCCCGTTCT CAGCCATGTAG-3′，长度115 bp。采用2-△△Ct法计算基因 mRNA 相对表达水平。

1.3.2 链霉卵白素-过氧化物酶（S-P）免疫组化染色法 将石蜡包埋的组织标本连续切片（厚度5 mm），用过氧化氢封闭内源性过氧化物酶（0.5%的甲醇溶液）15 min。在4℃下用一抗（Capn4 兔抗人抗体，以1∶50 稀释）处理切片。将切片与生物素标记的二抗在37℃孵育10 min。每个步骤之间，用PBS 缓冲液将切片洗涤3 次，并使用DAB染色观察免疫反应性。然后进行苏木精复染。在阴性对照中，一抗被PBS 缓冲液代替。Capn4 以细胞浆着色为阳性细胞，由两位病理科医师结合染色细胞所占百分比和染色强度做出判断。按阳性细胞所占肿瘤细胞的百分比评分：0 分（无染色细胞），1 分（<10%），2 分（10%～50%），3 分（>50%）；再按显色程度记分：0 分（无染色细胞），1 分（细胞被染浅黄色），2 分（棕黄色），3 分（棕褐色），两者相加≥3 分为阳性，0～3 分为阴性。

1.3.3 噻唑蓝（MTT）药敏试验 取肿瘤组织，消化培养法进行原代细胞培养，并调整细胞浓度为1×106个/L。取细胞悬液接种于96 孔板，100µL/孔。加入药物终浓度为药物1次快速静脉注射后理论最高血药浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素、丝裂霉素，同时设立对照组，置于37°C、5%CO2培养箱中培养48 h，加入50µL MTT，孵育4 h，上清液弃去，加入150µL DMSO，酶标仪570 nm 检测吸光度。抑制率（%）=（OD 对照组-OD 实验组）×100%/OD 对照组，其中抑制率≥30% 为敏感，<30%耐药。

1.3.4 随访 门诊或电话随访3～60 个月，末次随访时间为2020 年1 月，记录患者死亡时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，计量资料组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，计数资料组间比较采用χ2检验。Pearson 进行相关性分析，应用Kaplan-Meier 生存曲线和Log-rank 检验进行生存分析，Cox 比例风险回归模型分析影响患者预后因素，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-124 和Capn4 mRNA 水平比较

免疫组化染色法检测结果提示，癌组织中miR-124 相对表达水平（0.42±0.12）明显低于癌旁组织（1.12±0.25），差异有统计学意义（t=24.078,P<0.001）；Capn4 mRNA 在GEP-NENs 组织中的表达水平（1.39±0.42）高于癌旁组织相对值（0.68±0.15），差异有统计学意义（t=15.187,P<0.001）。

2.2 Capn4 蛋白的表达

Capn4 蛋白主要表达与细胞浆（图1），癌旁组织Capn4 蛋白的阳性表达率为6.59%（6/91），癌组织Capn4 蛋白的阳性表达率为68.13%（62/91），癌组织Capn4 蛋白的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=73.626,P<0.001）。

图1 Capn4 蛋白的表达（×200）

2.3 miR-124 和Capn4 mRNA 表达与临床病理参数的关系

miR-124 的低表达和Capn4 mRNA 高表达与GEP-NENs 的淋巴结转移、分化程度、TNM 分期相关，而与患者年龄、性别、吸烟史无关，见表1。

表1 miR-124 和Capn4 mRNA 表达与临床病理参数的关系（例）

2.4 MTT 药敏试验

药敏实验结果显示，胃肠胰神经内分泌肿瘤均对顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素、丝裂霉素敏感，miR-124 和Capn4 mRNA 表达水平与胃肠胰神经内分泌肿瘤对顺铂、5-氟尿嘧啶敏感有关。miR-124低表达、Capn4 mRNA 高表达胃肠胰神经内分泌肿瘤细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶敏感性低于miR-124 高表达、Capn4 mRNA 低表达的细胞（P<0.01）。而miR-124、Capn4 mRNA 表达水平与细胞对阿霉素、丝裂霉素敏感性无关（P>0.05）。见表2、表3。

表2 胃肠胰神经内分泌肿瘤对药物的敏感性

表3 miR-124 和Capn4 mRNA 表达与胃肠胰神经内分泌肿瘤敏感性关系（）

表3 miR-124 和Capn4 mRNA 表达与胃肠胰神经内分泌肿瘤敏感性关系（）

2.5 miR-124 和Capn4 mRNA 表达的相关性

通过miRanda 检索，显示miR-124 和Capn4存在结合位点。Pearson 相关性分析显示，GEP-NENs患者癌组织miR-124 和Capn4 mRNA 表达水平呈现负相关（r=-0.617,P<0.05）。见图2、图3。

图2 miR-124 和Capn4 预测结合位点

图3 miR-124 和Capn4 mRNA 表达的相关性

2.6 miR-124 和Capn4 mRNA 与胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤患者生存期的相关分析

在GEP-NENs 组织中，miR-124 低表达的患者与高表达的患者相比，总生存较差，Log-rank 法检验统计量，χ2=7.153,P=0.025。Capn4 高表达患者与低表达的患者相比，总生存较差，Log-rank 法检验统计量，χ2=8.137,P=0.019。见图4。

图4 miR-124 和Capn4 mRNA 高低表达患者的生存曲线

2.7 多因素Cox 回归分析

Cox 逐步多因素分析显示，淋巴结转移、组织学分级、TNM 分期、miR-124 和Capn4 均是GEP-NENs患者预后的独立影响指标。见表4。

表4 多因素Cox 回归分析

3 讨论

与以腺体形成癌为特征常见的胃肠胰腺癌不同，GEP-NENs 的特征是上皮小管腺结构的丧失，以及神经内分泌标记物分散表达。GEPNENs 大致分为两种组织病理学亚型：胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤（GEP-NETs）和胃肠道胰腺神经内分泌癌（GEP-NEC）［6］。GEP-NENs 的Ⅰ和Ⅱ期通常可以通过手术和放疗单独或联合治愈。晚期GEP-NENs（Ⅲ和Ⅳ期）的患者接受手术和化学疗法（单独或联合治疗）预后不理想［7］。目前，GEP-NENs 发病的分子机制仍不清楚，从分子生物学的角度寻找治疗GEP-NENs 的靶点和预后标记物是目前研究的热点，也可以标记物的变化水平为临床护理、诊断和治疗提供参考。

miRNA（～22 bp）是不编码蛋白质的内源RNA，但在转录和翻译水平上起调节作用［8］。miRNA 可通过碱基配对与靶mRNA 的3'-非翻译区序列结合，从而降解靶mRNA 或阻止靶mRNA 的翻译，并在肿瘤细胞的增殖，分化和恶性转化中发挥重要作用［9］。miR-124 在许多癌症组织（例如肝癌）中下调，并且可以抑制肿瘤的生长［10］。吴晓燕等［11］研究发现，宫颈癌患者癌组织中miR-124 相对表达量明显低于宫颈正常的患者的宫颈组织表达水平，与有无淋巴结转移、TNM 分期相关，提示检测宫颈癌组织miR-124 水平有助于判断与患者病情和预后，同时也说明miR-124 可以作为肿瘤治疗的新的靶点。本研究表明，患者癌组织中miR-124 mRNA 表达水平明显低于癌旁组织，miR-124的低表达与GEP-NENs 的淋巴结转移、分化程度、TNM 分期相关，而且miR-124 的低表达的患者与高表达的患者相比，总生存较差。Cox 逐步多因素分析显示，miR-124 是GEP-NENs 患者预后的独立影响指标，说明miR-124 参与了GEP-NENs 的发生和进展，可以作为预测GEP-NENs 预后的生物标记物，可以为临床护理、诊断和治疗提供依据。

Capn4 在肿瘤细胞中过表达，Capn4 水平高的患者预后较差，而且Capn4 表达的增加有助于局部肿瘤的侵袭和外周转移，对肿瘤的进展有重要影响。CHENG 等［12］研究发现Capn4 在结肠癌组织中的高表达，与结肠癌患者的肿瘤进展和预后显著相关。此外，体外实验显示Capn4 的表达增加增强了体外细胞的增殖，提示Capn4 在结肠癌中的致瘤作用，并可能成为结肠癌患者的潜在治疗靶标。而YANG 等［13］研究发现，Capn4 表达在卵巢癌组织中显著上调，与FIGO 分期、肿瘤等级和卵巢癌远处转移呈正相关。Kaplan-Meier 分析表明Capn4 高表达的患者的总生存期较短。此外，单变量Cox 回归分析表明Capn4 过表达是卵巢癌的不利预后因素，提示Capn4 有望成为卵巢癌患者新的预后指标。基于Capn4 在维持钙蛋白酶活性和稳定性中的重要作用以及钙蛋白酶异常表达是癌症的关键特征之一，确定Capn4 在GEP-NENs中的作用可能很重要。本研究中，患者癌组织中Capn4 mRNA 和蛋白表达水平明显低于癌旁组织，Capn4 的高表达与GEP-NENs 的淋巴结转移、分化程度、TNM 分期相关，而且Capn4 的高表达的患者与高表达的患者相比，总生存较差。Cox 逐步多因素分析显示，Capn4 是GEP-NENs 患者预后的独立影响指标，说明Capn4 参与了GEP-NENs 的发生和进展，可以为临床护理、诊断和治疗提供依据。

目前的研究表明，分析miRNAs 以及对应调控的靶基因，寻找潜在的肿瘤治疗靶点是目前研究的重点内容。研究显示，Capn4 的表达受到miR-124的负调控，可能是miR-124 的靶基因。HU 等［14］研究发现，与正常鼻咽细胞相比，鼻咽癌细胞系中Capn4 的表达升高，而miR-124 的表达降低。当预先表达miR-124 时，Capn4 表达水平下调，并进一步抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。此外，当预先表达Capn4 时，它逆转了miR-124 对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。这项研究显示miR-124可能通过负向靶标Capn4，调控鼻咽癌的发病机理，并有望成为鼻咽癌患者的治疗靶标。CAI等［15］研究发现，miR-124 在多形胶质母细胞瘤组织中显著下调，Capn4 表达明显上调。Spearman的相关性分析显示miR-124 表达与Capn4 蛋白水平之间呈负相关。迁移实验和Transwell 侵袭试验表明Capn4 下调或miR-124 上调抑制了胶质瘤细胞的迁移和侵袭，提示miR-124 通过Capn4 在体外抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。本研究通过Pearson 相关性分析显示，GEP-NENs 患者癌组织miR-124 和Capn4 mRNA 表达水平呈现负相关，提示miR-124 可能通过负向调控Capn4 的表达促进GEP-NENs 细胞的发生和进展。而MTT 试验显示，miR-124 和Capn4 mRNA 表达水平与胃肠胰神经内分泌肿瘤对顺铂、5-氟尿嘧啶敏感有关，提示miR-124 和Capn4 可能参与胃肠胰神经内分泌肿瘤的耐药作用，其机制可能与miR-124 调控Capn4表达水平影响细胞周期有关。利用基因技术上调miR-124 表达水平以下调Capn4 的表达，抑制GEP-NENs 癌细胞的转移和侵袭，提高其对化疗药物敏感性，可能也是治疗GEP-NENs 的潜在的方法。

总之，GEP-NENs 组织中miR-124 表达下调，Capan 蛋白水平上调，其中miR-124 负向调控Capan 蛋白的表达以促进GEP-NENs 的发生和进展，并影响其对化疗药物的敏感性，是潜在的治疗靶点和预后标记物。研究miR-124 和Capan 相互关系，可以用于预测预后并指导GEP-NENs 的临床护理、诊断和治疗。