黄芪多糖—壳聚糖/胶原组织工程支架在糖尿病大鼠皮肤缺损创面修复中的应用效果观察

梁旭，贺波，赵文懿，霍继武，陈宇，李光早

1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000；2组织移植安徽省重点实验室

糖尿病所导致的皮肤溃疡是最常见的糖尿病并发症之一，常因为糖尿病微血管病变与神经病变所导致［1-3］。自体皮肤移植因为其无免疫排斥等特性，在治疗糖尿病皮肤溃疡中取得了巨大的成功，但是其不可避免的新增手术伤口，同时自体皮肤来源不足等问题也限制了其在临床上的应用［4］。随着组织工程技术的发展，用以治疗糖尿病所致溃疡的组织工程支架成为关注焦点［5-6］，壳聚糖（CS）和胶原（COL）类支架是其中的一大热门。研究［7］显示，CS做为单一组分制作支架往往有几大缺点，如脆性较大、细胞黏附性较低等。而单用COL制作支架时，其成品性能存在降解速度快、力学性能较差等缺点［8］。将二者复合后，CS/COL复合支架不仅可以改善CS和COL各自原有的不足，既具有较好的生物相容性、可降解性和机械应力，并且微观下的网状立体空间结构，还有利于细胞迁移和交换［9］。但是，由于CS/COL复合支架缺乏生物活性成分，尤其是血管促进因子，在实际应用方面受到了限制。黄芪多糖（APS）是中药黄芪的主要活性成分［10］。研究［11］发现，APS可以通过促进创面和创周的血管新生，对糖尿病所导致的皮肤溃疡有着明确的治疗效果。为此，2020年9月1日—2021年5月20日，本研究使用冷冻干燥法制成APS-CS/COL支架，并观察了APSCS/COL组织工程支架在糖尿病大鼠皮肤缺损创面修复中的应用效果，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 大鼠、APS、CS、COL及试剂 雄性SD大鼠（SPF级）50只，体质量240～260 g，购于山东省实验动物中心。APS粉末（纯度>90%）、CS（脱乙酰度>90%）、I型COL均购于索莱宝公司。1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、冰乙酸、2-吗啉乙烷磺酸（MES）、无水乙醇、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等有机试剂均购于macklin公司。链脲佐菌素（STZ）购于yeasen公司。本实验经蚌埠医学院动物伦理委员会审核通过，批准文号：2020第145号。

1.2 APS-CS/COL、CS/COL组织工程支架的制备采用冷冻干燥法。配制足量低浓度（0.2 mol/L）乙酸溶液作为溶剂，适量分装为两份。取CS粉末溶于其中一份溶剂中充分溶解，配制20 g/L CS溶液。Ⅰ型COL溶于另一份，制成3.55 g/L I型COL溶液。称取APS粉末适量充分溶解于COL溶液中，将溶液离心30 s脱泡。称取MES溶解于体积分数40%的乙醇溶剂中，配制50 mmol/L MES溶液。称取EDC、NHS，将二者溶于MES溶液中，配制成含有50 mmol/L NHS、50 mmol/L EDC的混合溶液作为交联剂。以Ⅰ型COL溶液体积为标准，按照体积比3∶7加入适量CS溶液，将二者充分混合并加入适量交联剂，静置脱泡并在室温下交联6 h，即可获得APS-CS/COL组织工程支架。在不加入APS的情况下，以同样方法制备CS/COL组织工程支架。交联完成后使用移液枪500μL/孔注模，静置后置于零下20℃等待其充分冷冻固化，随后不间断冷冻干燥12 h。

1.3 糖尿病大鼠皮肤缺损模型的制备及分组 使用一次性快速注射STZ（拟定剂量为60 mg/kg）来诱导制备糖尿病大鼠模型［12-13］。注射STZ后，足食多水喂养10 d。取血测定3次血糖，每次血糖均≥16.7 mmol/L视为糖尿病大鼠模型造模成功。取糖尿病模型大鼠，深度麻醉后背部手术区域去除毛发，碘伏消毒后，使用皮肤打孔器在脊柱两侧制作直径1 cm的圆形皮肤全层缺损创面（见图1A），即为糖尿病皮肤缺损模型大鼠。将糖尿病皮肤缺损模型大鼠分为APS-CS/COL组、CS/COL组、对照组3组，每组15只。APS-CS/COL组大鼠使用APS-CS/COL组织工程支架进行创面修复，CS/COL组大鼠使用CS/COL组织工程支架进行创面修复，对照组不使用组织工程支架进行创面修复。取APS-CS/COL组织工程支架、CS/COL组织工程支架，75%乙醇浸泡6 h，PBS短时间浸泡，无菌水冲洗3次，PBS清洗1次，分别放置于皮肤创面上（见图1B），用无菌透气敷料覆盖，用4号无菌丝线缝合固定（见图1C）。

图1 糖尿病大鼠皮肤缺损模型的制备及创面修复过程

1.4 各组大鼠皮肤缺损创面愈合情况观察 ①创面大体情况观察。术后第7、14、21天，将大鼠放在适宜光线下，安抚大鼠使其保持安静，肉眼观察皮肤缺损创面部位的大体情况，并在同一角度下对皮肤缺损创面进行拍照。②创面愈合率测算。术后第7、14、21天，使用Image J软件处理创面图片，以创面处有正常皮肤及毛发覆盖视为愈合，计算创面愈合率。③创面再生皮肤组织形态观察。术后第7、14、21天，取大鼠创面新生组织，使用多聚甲醛固定后进行石蜡切片，常规HE染色后，在显微镜下观察大鼠再生皮肤组织形态。

1.5 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点创面大体情况比较 术后第7天，对照组和CS/COL组大鼠创面可观察到明显的炎症现象，APS-CS/COL组大鼠创面周围未见明显的炎症现象，创面中心处可见基底红润充血，少量肉芽组织已经新生，可观察到较薄的新生皮肤。术后第14天，对照组和CS/COL组大鼠创面部位仍有结痂存在，仍然存在炎症反应且创面面积较大，而APS-CS/COL组创面愈合进程较快，圆心处见小范围未愈。术后第21天，对照组和CS/COL组大鼠创面自圆周向内见少量上皮生长，大多被肉芽组织充填，新生白色毛发稀疏，APS-CS/COL组创面几乎完全被肉芽组织充填，原有创面上大部分已被上皮取代，并可见较多白色新生毛发。

2.2 各组大鼠不同时间点创面愈合率比较 各组大鼠术后第7、14、21天创面愈合率比较见表1。由表1可知，APS-CS/COL组大鼠术后第7、14、21天创面愈合率均高于CS/COL组和对照组（P均<0.05）。

表1 各组大鼠术后第7、14、21天创面愈合率比较（%，±s）

表1 各组大鼠术后第7、14、21天创面愈合率比较（%，±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与CS/COL组相比，#P<0.05。

组别APS-CS/COL组CS/COL组对照组创面愈合率术后第7天28.55±2.76*#25.54±1.75 21.55±3.12术后第14天65.76±6.30*#50.09±6.09 42.05±5.22术后第21天91.54±1.64*#86.88±2.30 83.75±2.81

2.3 各组大鼠不同时间点创面再生皮肤组织形态比较 各组大鼠不同时间点再生皮肤组织形态见图2。由图2可见，术后第7天，对照组大鼠创面可见较少量的成纤维细胞，大多被炎性渗出物填充，组织结构呈现松散状态；CS/COL组可观察到少量胶原纤维和成纤维细胞，创面组织已经开始出现修复迹象；APS-CS/COL组成纤维细胞较多，胶原纤维量明显增多，排列紧密，可观察到明显的微血管形成组织愈合迹象。术后第14天，对照组皮肤愈合进程较慢，皮肤真皮层仍见大量纤维细胞和少量胶原纤维，表皮层也较薄；CS/COL组可见大量胶原纤维分泌，胶原纤维排列并不紧致有序，分布于新生真皮层中，未见皮肤附属器的出现，表皮层的组织结构分化也不完全；APS-CS/COL组表皮层愈合进程快于前两者，已与正常皮肤表皮结构无较大差异。新生真皮层中可见少量的成纤维细胞，其余视野被大量紧致的胶原纤维填充，转换视野也可见到处于分化阶段的皮肤附属器。术后第21天，对照组创面新生皮肤成纤维细胞数量仍然较多，组织仍需进一步修复，表皮层分化不完全且较厚；CS/COL组同样可观察到新生血管、细胞附属器，但胶原纤维排列仍紧密，仍需进一步成熟；APS-CS/COL组创面新生皮肤组织结构和正常组织相似，表皮、真皮以及新生血管、细胞附属器等结构均完全形成。

图2 各组大鼠不同时间点创面再生皮肤组织形态（HE染色，×100）

3 讨论

糖尿病患者的溃疡创面是一种非常典型的慢性创面，由于创面灌注缺血缺氧，营养物质和代谢产物交换障碍等可导致出现上皮化延迟和肉芽组织形成不良等创面难愈现象［14］。在寻找自体皮肤移植代替物的过程中，组织工程技术一直都是有效且不断探索的策略［15-16］。COL具有抗原性低、炎症反应低、容易获取等天然优势，但其生物降解速率快、机械强度相对差。与另一种可以补充其不足的天然聚合物共混，是改变其生物降解速率并优化机械性能的较有效方法［17］。CS作为一种数量庞大的可再生能源［18］，具有优异的力学性能，本身无毒且具有一定的抗菌特性，在生物医学领域一直在被探索。与单一材料相比，CS/COL复合物已被报道在更高程度上增强了皮肤创面的愈合［19］。由于二者均不能释放活性因子促进组织生长，故需要寻找一种适宜负载的生物活性因子。YANG等［20］研究发现，APS可以通过增加周围皮肤血流量和微血管密度，促进糖尿病患者的伤口愈合。本研究通过冷冻干燥法并将促血管形成的APS负载于CS/COL复合支架，并评价其对糖尿病创面愈合的影响。

通过大体观察和愈合率的计算，结果均表明APS-CS/COL组愈合进程明显快于对照组和CS/COL组。CS/COL复合支架因其独特的多孔、疏松结构，与组织中的细胞外基质相似，不仅可以为创面修复提供较好的力学支撑，而且有利于细胞间营养物质交换运输，可以在组织愈合过程中补充细胞各种活动所需能量。除了上述物理特性之外，载APS组织工程支架可避免了创面直接给药造成的损失以及外界各种因素带来的影响，不仅在一定程度保护了糖尿病大鼠创面免受感染，而且在愈合过程中不断释放支架中的APS，可在局部创面起到一定程度的积极作用。

HE染色结果发现，APS-CS/COL组创面在不同时间点组织愈合进程显著快于对照组和CS/COL，术后第21天时APS-CS/COL组创面已基本愈合，愈合进程相比较对照组和CS/COL组明显更快，推测原因可能是在糖尿病大鼠创面修复过程中，APSCS/COL组通过不断释放的APS持续发挥其药理作用，从而促进肉芽组织生成，促进角质形成细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞等各种在组织愈合进程中起到积极修复作用的细胞的迁移、增殖和分化，加速了细胞外基质分泌和合成，促进细胞外基质在损伤部位的沉积以及上皮再生化，最终显著改善创面愈合情况。

综上所述，APS-CS/COL作为一种新型复合材料，具有安全、生物相容性好、具有一定的抗菌能力等特点，可明显促进糖尿病大鼠的创面愈合进程。