遵义烟区不同海拔下植烟土壤细菌群落及影响因素分析

李茂森 高卫锴, 任天宝 蒋石香 何小亚 骆乐琴 云 菲 柯晓婷

（1河南农业大学烟草学院/河南省生物炭研究工程技术中心/生物炭技术河南省工程实验室，450002，河南郑州；2广东中烟工业有限责任公司，510032，广东广州；3贵州省烟草公司遵义市公司，563000，贵州遵义）

海拔是烤烟种植区域类型选择的重要影响因素之一[1-2]，海拔的变化常常会导致环境发生显著变化，光、温、水、土等资源也会随之改变，影响土壤的发育和理化性质[3-4]。土壤微生物是评价土壤质量和健康状况的重要指标之一，对土壤外部环境的变化十分敏感[5]。土壤微生物在土壤生物地球化学循环过程中具有重要的作用[6]。研究[7]发现，土壤环境可以影响土壤微生物群落结构及其多样性，主要包括土壤含水量、pH和土壤类型等，其中土壤pH往往是支配土壤细菌群落结构和功能菌组成的首要因子。随着对土壤微生物研究的日益深入，微生物地理分布规律的研究受到广泛关注。虽然人们一直试图揭示土壤微生物群落组成、结构及多样性在空间上如何变化，以及它们与生态系统中物理、化学和生物特征的关系，但是对微生物的地理分布以及影响它们的生物和非生物因素知之甚少[5]。已有研究[8]认为，土壤微生物在水平梯度上具有空间分异规律。垂直梯度作为一种综合环境因子，会导致山地的生境差异及温度、光照、降雨、土壤等多方面环境因子的改变，影响物种多样性，进而造成土壤细菌群落组成在海拔梯度上的差异。

目前，植烟土壤微生物多样性方面前人已有较多研究，但关于不同海拔下植烟土壤微生物多样性的差异，以及导致不同海拔植烟土壤微生物多样性变化的环境主导因子方面的研究鲜有报道。因此，以贵州省遵义地区不同海拔下植烟土壤为研究对象，开展2个方面的研究：一是分析植烟土壤微生物群落结构多样性在不同海拔下的变化趋势；二是明晰植烟土壤中影响优势微生物群落的重要生态因子，以丰富不同海拔下植烟土壤细菌群落基础理论并为烤烟的大田管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况与材料

2020年在贵州省遵义市播州区下辖鸭溪镇鸭溪基地单元进行取样，该地区年降雨量1043.4mm，平均气温14.6℃，无霜期280d。地形以低山丘陵和岗前缓坡为主，海拔800～1200m。土壤以水稻土和山地黄壤为主。取样地点共有3处，其概况及土壤理化性质见表1。

表1 不同取样地点概况及植烟土壤理化指标Table 1 Physicochemical indexes of tobacco planting soil at different sample sites

供试烤烟品种为云烟87，3个海拔烤烟的移栽期、栽培及施肥技术措施完全相同。肥料为贵州省烟草公司统一提供的烟草专用肥，栽培措施按照《贵州特色优质烟叶生产规范》进行，2020年4月中旬移栽。3个海拔处理的烟株大田生育期基本相同。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 供试土壤与样品采集 2020年9月1日，在贵州省遵义市鸭溪基地单元沿着海拔按200m高度差进行采样，3个采样地，分别为江北咀、新华村和新土村，分别记为ZL、ZS和ZH。按5点取样法进行取样，每个处理取5株，收集完成后混匀并分为3部分，一部分用干冰保存在10mL无菌离心管中，用于检测微生物多样性；一部分保存于-4℃冰箱，用于检测土壤微生物量；一部分在阴凉处自然风干后研磨，用于分析土壤理化性质。

1.2.2 土壤理化指标及养分 参照《土壤农业化学分析方法》[9]测定土壤理化性质，对采样点做平行组。采用烘干法测定土壤含水率；采用环刀法测定土壤容重；以超纯水为浸提剂，按照土:水=1:2.5浸提，用精密pH计（型号：IS128C）直接测定pH；采用碳酸氢钠浸提法测定土壤速效磷含量；采用浓硫酸―重铬酸钾外加热法测定土壤有机碳含量；采用碱解扩散法测定碱解氮含量；采用氯仿熏蒸―硫酸钾浸提法测定微生物量碳、氮含量[10]。

1.2.3 土壤细菌多样性 使用E.Z.N.A.®soil试剂盒（OMEGA）进行土壤DNA提取和PCR扩增，利用 NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司）检测DNA纯度，检测合格后用338F和806R引物对V3-V4可变区进行PCR扩增[11]。

用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，混合后送IlluminaMiSeq平台进行基因序列测定[11]。

1.3 数据统计及分析

用Excel 2016整理数据，用SPSS 22.0进行方差分析以及主成分分析，用R软件的vegan包绘图。

2 结果与分析

2.1 不同海拔下土壤细菌α多样性

所有样品共获得有效序列 717 026条。依据97%序列相似性对所测序列进行聚类分析，样本平均OTUs数为4028。3个海拔处理的共有OTUs数为2466，高海拔处理OTUs数显著高于低海拔处理（图1）。

图1 不同海拔条件下土壤细菌群落OTUs数Fig.1 OTUs number of soil bacterial community at different altitudes

由表2可得，Simpson指数、Shannon指数和Chao指数均在 ZS和 ZH处理之间表现出显著差异，其中ZS处理的Shannon和Chao指数显著高于ZH处理，而Simpson指数则相反，土壤细菌多样性和群落丰富度在中低海拔地区表现较好。试验样本测序覆盖度均达到98%以上，满足后续分析。

表2 海拔对土壤细菌群落α多样性的影响Table 2 Effects of altitude on α diversity of soil bacterial community

2.2 不同海拔土壤细菌群落结构分析

2.2.1 土壤细菌门水平上物种相对丰度 如图2所示，植烟土壤中的优势菌门分别为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteriota），其相对丰度之和达到79.11%以上。不同海拔下，门水平上土壤细菌丰度具有一定的差异，放线菌门的相对丰度以ZL处理最高，相较于ZH处理提高了34.22%；变形菌门表现则相反，ZH处理变形菌门丰度较ZL处理有明显提高（图3）。绿弯菌门与酸杆菌门丰度在3个海拔中表现较为一致，均为ZS＞ZL＞ZH，其中ZL和ZH处理绿弯菌门和酸杆菌门丰度差异不大。

图2 门水平上细菌群落相对丰度Fig.2 Relative abundance of bacterial community on phylum level

图3 ZL和ZH处理门水平上细菌群落相对丰度比较Fig.3 Comparison of relative abundance of bacterial communities on phylum level between ZL and ZH treatment

2.2.2 对土壤细菌群落主成分的影响 土壤细菌群落结构主成分分析如图4所示，PC1轴和PC2轴对样本组成差异的贡献值分别为 47.09%和17.25%。由图4a可以看出，ZL与ZS处理样本点的距离较近，说明这2个处理的土壤细菌群落结构相似，但与ZH处理的距离较远，说明海拔对土壤细菌群落结构有明显的影响，且随着海拔的高度差变大，影响也变大。由图4b可以看出，ZL和ZS处理呈左偏态分布，且重合较多；ZH处理呈右偏态分布，与ZL和ZS处理表现出明显的分离。

2.3 不同海拔下土壤细菌群落结构与土壤环境因子的相关性分析

门水平上相对丰度前20名的细菌门类与土壤因子之间的相关关系如图5所示。pH、速效钾、温度和微生物量氮均对土壤细菌群落结构表现出显著性影响。其中变形菌门、拟杆菌门（Firmicutes）、髌骨菌门（Patescibacteria）和Armatimonadota与土壤微生物量氮和速效钾均显著相关。pH与蓝细菌（Cyanobacteria）和Armatimonadota显著正相关（P＜0.01和P＜0.001），与变形菌门显著负相关；土壤含水率与Armatimonadota、蓝细菌和绿弯菌门显著正相关，与变形菌门显著负相关。

图5 土壤细菌优势门类与环境因子之间的相关关系Fig.5 Correlation between bacterial dominant phylum and environmental factors

3 讨论

3.1 不同海拔下植烟土壤理化特性

土壤养分含量随海拔、土壤类型等环境条件的变化而产生较大的差异[12]。研究[13-17]表明，随着海拔的变化，土壤光、温、水、热等资源会产生很大的差异，造成土壤pH以及土壤基础养分的变化。

烤烟对土壤酸碱度的适应能力较强，在pH为4～9的土壤环境中均能生长，但土壤pH 5.5～6.5最适合优质烟叶的生产。本研究结果表明，低海拔土壤pH显著低于中海拔，但高于高海拔，低海拔土壤pH最适宜烤烟生长，高海拔土壤pH较低，在施肥时应适当增施碱性肥料。邓小华等[14]研究发现，海拔对湘西州植烟土壤pH有显著影响，随海拔升高pH有降低的趋势。刘琼峰等[17]的研究发现，张家界烟区植烟土壤pH在800m以下海拔差异不大，但800m以上的土壤pH显著低于低海拔土壤。已有研究[18-19]表明，植烟土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾等养分在高、中、低海拔间差异显著。土壤有机质和碱解氮决定了土壤供氮能力，植烟土壤有机质含量以10～30g/kg为宜。本研究结果表明，高海拔土壤有机质含量显著高于低海拔，这与焦敬华等[18]研究结果一致。本研究中3个海拔高度有机质含量均适宜优质烟叶生产，但中海拔地区土壤碱解氮含量较低，适量增施氮肥更有利于烤烟生长。低海拔土壤速效磷含量显著高于中海拔，这与朱三荣等[19]研究结果相反，这可能是由于取样地区生态环境不同造成的。高海拔地区速效钾含量低于植烟土壤适宜范围（150～220mg/kg），在该地区增施钾肥更适宜烤烟生长。

3.2 不同海拔下植烟土壤细菌群落组成及多样性

土壤微生物群落组成及多样性是反映土壤微生物群落生态功能的重要指标，在本研究中，3个不同海拔的土壤细菌Simpson指数、Shannon指数和Chao指数均呈显著性差异，其中中低海拔细菌Simpson指数低于高海拔，而Shannon指数和Chao指数则高于高海拔，说明中、低海拔更有利于土壤微生物生长，从而增加土壤生态系统的稳定性。研究[20]发现，Simpson指数与海拔呈显著负相关，说明随着海拔的降低土壤微生物的物种多样性和丰富度增加，从而增加土壤生态系统的稳定性。高静等[21]研究认为，高寒草甸土壤固碳微生物丰度和多样性随海拔的上升显著提高。土壤微生物是维持土壤生态系统稳定的重要组成部分，微生物的丰富度和数量的增大会明显提高整个土壤生态系统的稳定性和多样性。基于OTUs丰度的土壤菌落结构主成分分析表明，土壤微生物群落结构随着海拔的变化出现明显的分离，中、低海拔土壤细菌群落结构相似，而其与高海拔的细菌群落结构出现明显的分离。

3.3 不同海拔下植烟土壤细菌群落结构与土壤因子的关系

温度、水分、pH等理化性质对土壤有机质含量具有重要的影响，环境因子通过影响土壤微生物的活性和丰度来间接控制土壤有机碳的周转速率[22]。Lynn等[23]研究认为，土壤中参与碳固定的细菌类群多样性与土壤类型、土壤环境因子等显著相关。本研究表明，土壤细菌群落结构受多种环境因子的驱动调节，土壤变形菌门、拟杆菌门、髌骨菌门、Armatimonadota、蓝细菌和绿弯菌门与土壤速效钾、pH、温度、含水率和微生物量氮含量有明显的相关性，变形菌和放线菌是土壤中丰度较高的菌群。变形菌含有尿素酶，可以分解尿素，固定土壤中的氮素，放线菌大多为腐生菌，参与土壤物质循环和能量转换。本试验结果表明，低海拔地区土壤放线菌丰度较高，这更有利于土壤有机质的分解利用。研究[24]表明，海拔可显著影响土壤微生物群落，并且在不同海拔梯度下土壤pH和地上植被组成与土壤微生物群落存在极明显的相关性。研究[25]发现，随着海拔升高，OTU数和微生物种群组成都会发生明显的变化。Zhang等[26]研究发现，植被通过改变土壤 pH和 C/N进而对土壤微生物群落组成产生影响。张杰等[27]认为，不同植被群落下的土壤细菌群落结构存在显著差异。该研究中，不同的海拔梯度下土壤细菌群落之间存在显著差异。因此推测，不同海拔梯度下的植被类型通过改变pH和土壤有机碳间接影响细菌分布。土壤对烤烟的产量和质量具有直接的影响，海拔的改变直接造成局部地区土壤发育和土壤理化性质的变化，从而对烟草种植造成影响。通过适当的栽培管理措施，可以减轻海拔变化对烟草品质造成的不利影响。冯慧琳等[11]研究发现，通过施加生物炭能够显著提高植烟土壤酶活性及土壤养分，改善土壤微生态环境，促进根际土壤细菌群落的变化。另有研究[28]发现，生物炭对土壤微生物量碳和氮含量有显著性提高，施加生物炭提高作物的矿化效率，提高烤烟的产量和质量，增加烤烟的可利用性。本研究通过研究不同海拔下土壤pH和养分的差异，寻找土壤细菌群落和土壤因子的相关性，为烤烟的生长管理提供一定的参考。

4 结论

不同海拔下植烟土壤细菌群落表现出一定的差异性，低海拔地区土壤细菌群落丰度高于高海拔地区。影响细菌群落结构的关键因子为土壤pH、温度、含水率和土壤微生物量氮含量。不同海拔植烟地区土壤环境因子差异影响微生物多样性以及群落结构。