DEP1与NRT1.1B基因的遗传互作对水稻氮素利用的影响

李 旭 付立东 王 宇 隋 鑫 任 海 吕小红 马 畅 杜 萌 毛 艇

（辽宁省盐碱地利用研究所，124010，辽宁盘锦）

氮素是水稻生长发育的必需元素，适量施氮可以提高产量，而过量施氮不仅造成氮素浪费，还会增加植株倒伏和病虫害发生的风险[1-3]。已有研究[4-5]表明，我国水稻生产的氮肥利用效率在25%～35%之间，较国际平均水平低 5%～10%。因此，提高氮素利用效率成为水稻遗传改良的重点攻关方向。

培育氮高效水稻品种是提升氮素利用的有效途径[6-7]。随着分子生物学的发展，AMT、GOGAT、GS、NR、NRT、DEP1、NRT1.1B等参与水稻氮代谢调控的基因被成功克隆[8-12]，为进一步标记辅助育种工作提供了坚实基础。其中，DEP1及NRT1.1B基因被证实具有较大的应用价值[13-14]。Hu等[13]利用籼粳稻杂交后代群体，成功克隆了氮素吸收与利用的关键基因NRT1.1B，该基因在籼、粳亚种间存在1个碱基变化，导致了相应氨基酸的变化，使得籼亚种氮素利用效率高于粳亚种。相比于NRT1.1B基因，DEP1是一个同时影响植株形态、稻谷粒型及氮素利用的多效基因，Huang等[15]、Yan等[16]和Zhou等[17]相继于第9条染色体上克隆了该基因，命名为DEP1、EP1或qPE9-1。Sun等[14]研究表明，直立穗等位基因dep1使得水稻营养生长对氮素的响应变得迟钝，因此可以同化更多的氮素，从而提高氮素利用效率。

由于通风透光好和易于密植的群体特征，直立穗等位基因dep1被广泛应用于我国的超高产水稻育种[18-19]。因此，深入解析dep1与NRT1.1B基因的遗传互作对水稻氮素利用的影响，对培育氮高效水稻品种具有重要指导意义。本文以携带不同DEP1与NRT1.1B基因型组合的重组自交系为供试材料，在低、中及高氮条件下，分析了DEP1与NRT1.1B基因的遗传互作对水稻氮素利用、产量及其构成因素的影响，并探讨了氮高效水稻品种培育的有效途径，为氮高效利用分子设计育种提供优异种质和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与种植方法

供试材料为粳稻品种盐丰47（YF47）与籼稻品种黄花占（HHZ）杂交构建的142个F10代重组自交系（RIL）群体。试验于2020年在辽宁省盐碱地利用研究所试验田（辽宁盘锦，41.07°N，122.03°E）进行。设置低、中及高 3个氮肥处理，分别记为LN、MN和HN，对应的氮肥施入量分别为100、200和300kg/hm2，均按照底肥:分蘖肥:穗肥=5:3:2施用，P2O5（90kg/hm2）和K2O（60kg/hm2）均作底肥一次性施入。随机区组设计，3次重复，小区面积20m2，行距30cm，株距13.3cm。

1.2 DEP1与NRT1.1B的基因型鉴定

以重组自交系亲本及后代为DNA模板，利用基因DEP1-1及1nrt/1NRT的分子标记进行鉴定[20-21]，引物详细信息见表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 指标测定及方法

1.3.1 茎鞘及籽粒中氮素含量、积累量及氮素收获指数 参考赵明珠[22]的方法，于黄熟期取长势较一致的10株水稻，将茎鞘和籽粒分开，烘干至恒重，计算单株茎鞘和籽粒的生物量；并取0.6g样品，通过全自动碳氮分析仪（Elementar，Vario MAX CN，德国）测定茎鞘及籽粒中氮素含量。利用公式氮素收获指数=籽粒氮素积累量/（籽粒氮素积累量+茎鞘氮素积累量），计算氮素收获指数。

1.3.2 氮代谢关键酶活性 于DEP1/NRT1.1B、DEP1/nrt1.1b、dep1/NRT1.1B及dep1/nrt1.1b4个基因型组合中分别选取 10个典型株系，于抽穗前用红色马克笔标记同一天开花的颖花100个，于齐穗后10d进行标记颖花胚乳取样，参照赵明珠[22]的方法测定硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性。

1.3.3 产量及其构成因素 于黄熟期对每个重复取长势较一致的10株水稻，调查有效穗数、穗粒数及千粒重；黄熟期后收获，取1m2测产，折算成14.5%含水量的产量。

1.4 数据分析

利用Graph Pad Prism ver.5.0和Microsoft Office Excel 2007进行图表绘制及数据分析。

2 结果与分析

2.1 DEP1与NRT1.1B基因在重组自交系群体中的分布

利用表1中的标记进行检测，RIL中存在4种基因型组合，分别为DEP1/NRT1.1B、DEP1/nrt1.1b、dep1/NRT1.1B及dep1/nrt1.1b，对应株系数分别为36、35、44及27（图1）。盐丰47携带高氮素利用等位基因dep1及低氮素等位基因NRT1.1B，黄花占携带低氮素利用等位基因DEP1及高氮素等位基因nrt1.1b。

图1 RIL群体中DEP1与NRT1.1B不同基因型组合株系数Fig.1 Number of lines of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes in RILs

2.2 DEP1与NRT1.1B基因对茎鞘及籽粒中氮素含量的影响

由图2a～c可得，LN水平下，dep1及nrt1.1b导入均可显著增加茎鞘中氮素含量，同时聚合dep1及nrt1.1b基因型品系茎鞘中氮素含量最高；MN水平下，dep1基因型的导入可显著增加茎鞘中氮素含量，而nrt1.1b基因型导入未显著增加茎鞘中氮素含量；HN水平下，dep1及nrt1.1b对茎鞘中氮素含量影响均较小，4种基因型组合间差异均未达到显著水平。由图2d～f可得，LN和MN水平下，不同基因型组合间籽粒中氮素含量差异不显著；HN水平下，dep1基因型的引入显著提升了籽粒中氮素含量，而nrt1.1b对籽粒中氮素含量的影响未达到显著水平。

图2 RIL群体中不同DEP1与NRT1.1B基因组合对氮素含量的影响Fig.2 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on N contents in RILs

2.3 DEP1与NRT1.1B基因对氮素收获指数的影响

由图3可知，LN条件下，dep1及nrt1.1b对氮素收获指数提高均有一定贡献，但未达到显著水平，2个基因型共同作用下，其氮素收获指数显著提高；MN和HN水平下，nrt1.1b基因对氮素收获指数的影响未达到显著水平，而携带dep1基因型株系氮素收获指数显著提升，dep1/nrt1.1b组合的氮素收获指数最高。

图3 RIL群体中不同DEP1及NRT1.1B基因组合对氮素收获指数的影响Fig.3 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on nitrogen harvest indexes in RILs

2.4 DEP1与NRT1.1B基因对氮代谢关键酶活性的影响

从4种基因型组合中各选取了10个株系进行硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性的比较。由图4a可知，在LN条件下，nrt1.1b基因型有利于提高硝酸还原酶活性，dep1基因对硝酸还原酶活性无显著影响；而MN和HN条件下，4种基因型组合间硝酸还原酶活性无显著差异。同样条件下比较谷氨酰胺合成酶活性（图4b），不同氮素水平下，dep1基因均有利于提高谷氨酰胺合成酶活性，而nrt1.1b基因对谷氨酰胺合成酶活性无显著影响。

图4 RIL群体中不同DEP1与NRT1.1B基因组合对硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig.4 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on NR and GS activities in RILs

2.5 DEP1与 NRT1.1B基因对产量及其构成因素的影响

由表2可知，不同氮肥水平下，dep1基因引入均有利于单株有效穗数的增加，而NRT1.1B基因对单株有效穗数未产生显著影响；同样dep1基因引入也显著提升了穗粒数；NRT1.1B基因对千粒重无显著影响，而dep1基因引入则显著降低了千粒重。携带dep1基因株系产量均值高于其他株系，而NRT1.1B基因未对产量产生显著影响。

表2 RIL群体中不同DEP1及NRT1.1B基因组合对产量及其构成因素的影响Table 2 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on yield and its components in RILs

3 讨论

氮素利用效率在籼稻与粳稻间存在显著差异，籼稻的氮素利用效率高于粳稻，其中，NRT1.1B是产生上述现象的关键基因[13]。籼粳稻杂交育种是我国水稻育种的重要方法之一[23-24]，而源于籼稻的高氮素利用率基因型nrt1.1b在粳稻中极少被检测到[13]的原因值得深入分析。从本研究来看，LN条件下，nrt1.1b基因型提升氮素利用效率的作用更为显著，且nrt1.1b基因型对产量的影响未达到显著水平；因此，在目前连年施氮、土壤氮素含量较高的情况下，nrt1.1b基因型未体现出其高氮素利用的功能优势，导致在育种过程中未被特意选择，因此较少在粳稻中被检测到，这与Hu等[13]及赵明珠[22]的研究结果较为一致。

本文通过 RIL群体分析了不同氮素施入条件下，dep1及nrt1.1b基因在氮素利用效率提升方面的应用价值。综合分析，LN条件下，nrt1.1b基因的引入可显著提升氮素利用效率，这源于其硝酸还原酶活性的提升，增加了硝态氮的利用效率；而MN和HN条件下，dep1提升氮素利用效率的作用更为显著，谷氨酰胺合成酶活性的提升增强了其氮素转运能力是其主要原因。dep1等位基因的应用有利于进一步提升有效穗数和穗粒数，这也是该基因在粳稻高产育种被广泛应用的主要原因。

氮素利用是复杂的数量性状，受多个基因位点的调控[22]，利用RIL群体开展研究，可能受到其他未知氮素利用基因的影响。因此，计划构建dep1及nrt1.1b不同组合的近等基因系，进一步明确上述基因在粳稻育种氮素利用效率提升中的应用价值。

4 结论

源于籼稻的高氮素利用率基因nrt1.1b在粳稻育种中具有一定的应用价值。nrt1.1b基因在中、高氮水平下作用较小，但不同氮素条件下，dep1/nrt1.1b组合均具有最大的氮素收获指数，在育种工作中可以利用dep1及nrt1.1b基因的加性效应提高其氮素利用效率，较单一利用dep1基因更具优势；针对中、低产田，可以利用nrt1.1b基因提高氮素利用效率，从而减少氮肥施入。