不同加工方式对大球盖菇水提液挥发性风味成分和抗氧化能力的影响

卢 琪，薛淑静，杨 德，王少华，李 露

（湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所, 湖北武汉 430064）

大球盖菇（Stropharia rugosoannulataFarl.）又称皱球盖菇、酒红球盖菇，在世界范围内广泛种植[1]。大球盖菇不仅产量高，其口感清爽宜人，具有较高的经济价值，因此联合国粮农组织推荐其在发展中国家种植，并公认为其是国际市场上的十大蘑菇之一[2−3]。大球盖菇能够在户外种植，并以秸秆为培养基，分解秸秆，同时大球盖菇收获后的残渣又能为大田提供养分，实现农业种植的绿色循环。我国于1992年引进大球盖菇，目前已在全国范围内大量推广种植[4−5]，大球盖菇产量大，成熟期相对集中，而新鲜的大球盖菇贮藏期短，因此大球盖菇加工技术的研发迫在眉睫。

除了干燥、腌渍和罐藏外，调味料的加工也是食用菌的加工方向之一[6]。大球盖菇被证实富含各类营养和抗氧化成分，具有预防心脏病、高血糖、腹水癌等作用，同时其中含有丰富的氨基酸、核苷酸、有机酸、可溶性糖等，是理想的功能型调味料加工原料[2,7]。目前，食用菌调味料可通过喷雾干燥、溶剂提取、蒸馏等方式获得，也可直接粉碎后复合到其它调味料中[8−9]。如何使大球盖菇呈味成分分散溶解是加工的关键，挥发性风味成分也是食用菌呈味的关键。食用菌的热处理，如漂烫、高压蒸汽、微波处理等均对其风味有所影响，而非热加工对其挥发性风味成分的影响尚未研究。超微粉碎技术在茶产业中的应用，可以改善茶液的颜色、风味和营养[10−11]，而其对大球盖风味品质的影响尚未研究。本文基于热加工（70 、90 ℃）和非热加工（室温、超声、均质和超高压），对比各工艺对不同粒径大球盖菇水提液风味品质的影响，以期为大球盖菇在调味市场的精深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata） 于2019年12月采收于湖北武汉；正构烷烃（C6~C25） 色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；Folin-Ciocalteu试剂、抗坏血酸、2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1,3,5-三（2-吡啶基）-2.4.6-三嗪（TPTZ） 源叶生物科技有限公司；ABTS•+试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。

PEN3电子鼻 德国Airsense公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用设备 美国Agilent公司；50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国 Supelco公司；手动固相微萃取进样器 美国Supelco公司；Multiskan GO酶标仪 美国Thermo Fisher公司；XHF-DY高速均质机 宁波新芝生物科技有限公司；KQ5200DE超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；HPP-650超高压设备 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司；YR-6L超微粉碎机 济南银润包装机械有限公司；winner 3003激光粒度分析仪 济南微纳科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同粒径菇粉的制备 新鲜的大球盖菇，采收后清洗、切片后45 ℃热泵干燥12 h。经粉碎机粗粉过80目筛后分别进行超微粉碎10 min和30 min[12]，进一步对过筛及超微粉碎后的菇粉进行粒径检测，对应的菇粉粒径分别为（181.25±1.46）、（36.63±0.45）和（7.06±0.08）μm。分别用 P1、P2和 P3代表上述粒径的菇粉。

1.2.2 大球盖菇水提液的制备 将上述不同粒径的菇粉分别采用热加工和非热加工的手段制备大球盖菇水提液。1.0 g菇粉中加入30 mL蒸馏水（1:30 w/v），浸泡0.5 h，然后进行以下处理：a.热处理，将上述混合物至于磁力搅拌器上以700 r/min的速度搅拌1 h，温度设置为70 ℃和90 ℃。处理结束后样品立即用冷水冷却；b.超声处理（UT），将上述混合物至于超声清洗仪，于40 kHz下于室温下提取1 h；c.均质（HG），将混合物置于均质机，采用18000 r/min的转速，室温 3 min，处理两次；d.超高压处理（HHP），上述混合物置于超高压装置内，室温条件下，500 MPa保持10 min；e.室温（RT），700 r/min 的速度下搅拌 1 h。

1.2.3 电子鼻分析 采用PEN 3便携式电子鼻对大球盖菇挥发性成分进行分析[13]。将10 mL大球盖菇水提液置于顶空瓶中，30 ℃水浴及磁力搅拌条件下平衡30 min后插入Luer-lock针，电子鼻系统以300 mL/min的流速吸收顶空瓶中的挥发性气体成分，送入传感器。传感器进行气味分析，每秒采集一次进行测量，采集时间为180 s。

1.2.4 GC-MS分析 采用GC-MS对大球盖菇挥发性成分进行分析[14−15]。10 mL大球盖菇水提液置于螺口瓶中，加入NaCl 4 g，于40 ℃平衡10 min后，采用DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取头，顶空吸附35 min。萃取结束后将萃取头立即插入GC进样口，250 ℃条件下解吸5 min[16]。GC参数为：程序升温的起始温度为40 ℃，保持1 min；以10 ℃/min 的速率升温至70 ℃，保持2 min；再以3 ℃/min 的速率升温至 105 ℃，保持 1 min；再以 10 ℃/min 的速率升温至 180 ℃，保持 2 min；最后以10 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持3 min；MS参数设置为：EI离子源，电离温度，230 ℃；电子能量，70 eV；四极杆温度，150 ℃；质谱扫描范围（m/z）35~400。挥发性成分通过质谱数据和比对（Wiley7.0和NIST05数据库），列出匹配度大于80%的成分，并对比同一色谱条件下正链烷烃（C6~C25）标准品的出峰时间，参考前人的研究，对各挥发性成分进行定性分析，各挥发性成分用GC-MS峰面积来横向对比[16]。

1.2.5 抗氧化能力分析

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 大球盖菇水提液DPPH自由基清除能力参照之前的研究略有改动[17−18]：65 μmol/L 的 DPPH 乙醇溶液 280 μL 与 20 μL的大球盖菇水提液混合，置于96孔板中，室温放置30 min后于517 nm下测量吸光值。以Vc作为阳性对照进行相对定量（y=0.0012x+0.0438，R2=0.997）大球盖菇水提液DPPH自由基清除能力的结果以每毫升大球盖菇水提液中抗坏血酸当量表示（μmol AAE/ mL）。

1.2.5.2 FRAP铁离子还原能力的测定 大球盖菇水提液FRAP铁离子还原能力参照之前的研究略有改动[17−18]：280 μL 的 Ferric-TPTZ 试剂中加入 20 μL 大球盖菇水提液，置于96孔板中，室温放置30 min于593 nm处测量吸光度。以Vc作为阳性对照进行相对定量（y=0.0029X+0.114，R2=0.998）。大球盖菇水提液FRAP铁离子还原能力表示为每毫升大球盖菇水提液中抗坏血酸当量（μmol AAE/ mL）。

1.2.5.3 ABTS自由基清除能力测定 大球盖菇水提液ABTS自由基清除能力参照试剂盒说明书进行操作：200 μL 的 ABTS•+溶液中加入 10 μL 大球盖菇水提液，置于96孔板中，室温放置6 min于734 nm处测量吸光度。以Trolox作为阳性对照进行相对定量（y=0.3025X+0.076，R2=0.996）。大球盖菇水提液ABTS自由基清除能力表示为每毫升大球盖菇水提液中Trolox当量表示（μmol TE/ mL）。

1.3 数据处理

以上实验数据均重复三次取平均值。采用Duncan分析进行样本差异性分析（IBM SPSS Statistics 20.0），P<0.05为显著性差异。XLSTAT 2014进行主成分和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻分析

采用电子鼻能够高效、快速的区分挥发性成分的气味信号[19]。图1显示了同一粒径条件下各加工方式对大球盖菇水提液挥发性成分的影响。很显然P1与P2条件下，各处理中大球盖菇水提液主要挥发性风味成分的电子鼻响应程度均表现为：超声>超高压>室温>均质>70 ℃>90 ℃。虽然热处理能促进食用菌呈味核苷酸的溶出，增加其鲜度[20]，但同时极大程度削减了其挥发性成分。非热处理超声和超高压能够丰富大球盖菇挥发性成分。室温条件下，甲基类成分（W1S）的电子鼻响应略高于其它处理，可能是由于此类物质比较不稳定，任何加工方式均能降低其电子鼻响应。P3条件下，除了两种热处理外，其它处理对大球盖菇挥发性成分电子鼻响应的差距不大，说明超微粉碎到一定程度已经削弱了大球盖菇挥发性成分。

图1 不同粒径条件下各处理条件下大球盖菇提取液的电子鼻雷达图Fig.1 Radar image of electronic nose obtained from S.rugosoannulata extracts processed by different methods

对比同一处理条件下（室温、70 ℃、90 ℃、超声、均质及超高压）三种粒径大球盖菇水提液的电子鼻响应值，除90 ℃加热处理外，其它各组处理中大球盖菇水提液挥发性风味成分的电子鼻响应程度均表现为P1>P2>P3，说明粒径的减小直接破坏大球盖菇挥发性风味成分。超微粉碎能够增加物料的表面积，对于农产品的营养成分和植物化学物质含量有直接的影响，可用于开发相关衍生食品[20−21]。然而，超微粉碎过程中的剧烈碾压破碎可能直接破坏了大球盖菇挥发性成分。非热加工的超声和超高压处理，使得大球盖菇水提液中硫化物和萜烯类成分（W1W）、芳香成分及有机硫化物（W2W）和氮氧化物（W5S）格外丰富。其它处理中除上述成分外，甲基类成分（W1S）亦占有一定比重。90 ℃加热处理下，三种粒径大球盖菇挥发性相近，且均小于其它处理，可能由于高温处理对挥发性成分具有进一步的破坏作用。

2.2 GC-MS分析

如表1所示，18种大球盖菇水提液中共鉴定出47种挥发性成分，主要包含醇类、醛类、酮类、酯类、烷烃类及少量的杂环类。在六种处理方式中超微粉（P3）的挥发性成分含量最低，说明超微粉碎过程破坏了大球盖菇挥发性成分。菇粉P1的挥发性成分含量最高，对应各处理对挥发性成分的排序为：超声>超高压>室温>均质>70 ℃>90 ℃，与电子鼻实验结果一致。超声处理条件下，大球盖菇水提液挥发性成分不仅含量高，挥发性成分个数最为丰富。己醇、1-辛烯-3-醇和己醛是大球盖菇水提液中的重要成分，三者之和占总挥发性成分的75.02%~95.70%。

表1 不同加工条件下大球盖菇提取液挥发性成分分析Table 1 Comparison of volatile compositions of S.rugosoannulata extracts processed by different methods

续表1

大球盖菇水提液挥发性成分的PCA分析如图2所示。本文以加工方式及挥发性成分为原始变量进行PCA分析，取其中2个主要成分F1=30.76%，F2=22.15%。由图2a 可知，主要成分己醛和1-辛烯-3-醇在第一象限，与主成分1和主成分2呈正相关，由图2b可知，与此类成分相关的处理为UT-P1、UT-P2和HHP-P1。2-十一酮、苯甲醛、十四烷、十六烷、邻苯二甲酸二乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基十一烷、2,6-二甲基十一烷、4,8-二甲基十一烷、3,4-二甲基戊烯、戊基丁内酯和3,6-二甲基癸烷在PCA图中的第二象限，与主成分1负相关，与主成分2正相关，与此类成分对应的加工手段为70 ℃-P1、70 ℃-P2、70 ℃-P3 和 HHP-P3。2-环己烯-1-酮、N-己基甲胺、环丁醇、庚醇、2-正戊基呋喃和二十五烷在PCA图中的第三象限，与主成分1和主成分2呈负相关，与此类成分对应的加工手段为90 ℃-P1、90 ℃-P2、90 ℃-P3、HG-P3、HG-P2、HHP-P2、UT-P3和 RTP3。十二烷、4-甲基十二烷、壬醇、戊醛、己酸乙酯、戊醛、丙位癸内酯、甲基壬基甲酮、2-甲氧基呋喃、辛醇、丙位壬内酯和己醇与主成分1正相关，与主成分2负相关，与此类成分对应的加工手段为HG-P1、RT-P1和RT-P2。图3基于挥发性成分对大球盖菇加工方式进行聚类分析，除UT-P3外，其它加工手段下的3种粒径聚为一类，说明加工手段决定着大球盖菇挥发性成分组成。上述加工方式可分为四类即超声处理P1、P2中挥发性成分丰富，含量高，聚为一类。热处理减少了其中挥发性的成分，且处理温度越高，挥发性成分丧失严重，所以70 ℃和90 ℃处理的大球盖菇各聚为一类。其它的非热处理（室温、均质和超高压）得到的大球盖菇挥发性成分数量和含量居中，合并聚为一类。

图2 大球盖菇水提液挥发性成分主成分分析图Fig.2 Principal component analysis (PCA) of volatile compounds in S.rugosoannulata water extracts

图3 基于挥发性成分的不同大球盖菇水提液加工方式聚类分析图Fig.3 Representation of volatile compounds of S.rugosoannulata extracts resulting from agglomerative hierarchical clustering (AHC)

2.3 抗氧化能力分析

通过DPPH、ABTS和FRAP法综合评价18种加工方法中大球盖菇水提液的抗氧化能力(表2)，并进一步通过双因素方差分析对比加工方式和菇粉粒径对大球盖菇水提液抗氧化性能影响(表3、表4、表5)。抗氧化机理可分为单电子转移机制（SET）和氢原子转移机制（HAT）[22−23]。DPPH 抗氧化原理是基于自由基清除作用，反应时间短，操作简单[24]。本研究中热处理显著降低了大球盖菇水提液的DPPH自由基清除能力，非热加工的各处理中，大球盖菇水提液的抗氧化能力均随着大球盖菇粒径的减少而减弱。RT-P1的大球盖菇水提液DPPH清除能力最强。由表3可知，加工方法和粒径均对大球盖菇水提液的DPPH值有显著影响（P<0.001），且两者交互作用显著（P=0.001）。

表2 不同处理条件下大球盖菇提取液抗氧化能力对比Table 2 The comparison of antioxidant abilities of S.rugosoannulata extracts processed by different methods

表3 不同加工方法和粒径处理条件下大球盖菇水提液DPPH值方差分析结果Table 3 Variance analysis of DPPH value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

ABTS法的抗氧化原理为抗氧化剂存在时能够将抑制ABTS自由基的形成，降低体系颜色，此法体现了体系的总抗氧化能力，同DPPH法，ABTS法同时兼具SET和HAT原理[25]。除70 ℃热处理外，其它大球盖菇水提液的ABTS离子清除能力随着大球盖菇粒径的减少而降低。RT-P1的ABTS离子清除能力最强。由表4，加工方法和粒径均对大球盖菇水提液的ABTS值有显著影响（P<0.001），但两者交互作用不显著（P=0.102）。

表4 不同加工方法和粒径处理条件下大球盖菇水提液ABTS值方差分析结果Table 4 Variance analysis of ABTS value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

FRAP属于单电子转移（SET）反应原理，体现抗氧化剂的还原性[26]。本研究各处理得到的大球盖菇水提液的FRAP值均随着菇粉粒径的减少而增大，且热处理所得大球盖菇水提液的铁离子还原能力要显著高于非热处理，90 ℃-P3得到的大球盖菇水提液铁离子还原能力最强。由表5可知，加工方法和粒径均对大球盖菇水提液的ABTS值有显著影响（P<0.001），但两者交互作用不显著（P=0.151）。超微粉碎和热加工均能降低大球盖菇水提液的DPPH和ABTS自由基清除能力，而超微粉碎结合热处理却增加了大球盖菇水提液的铁离子还原能力，可能是由于高强度的处理释放了大球盖蛋白螯合金属，增强了体系的还原性，与之相关的原理有待进一步研究。

表5 不同加工方法和粒径处理条件下大球盖菇水提液FRAP值方差分析结果Table 5 Variance analysis of FRAP value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

3 结论

采用热处理（70、90 ℃）和非热处理（室温、均质、超声和超高压）加工不同粒径的大球盖菇（P1、P2、P3），获得对应的大球盖菇水提液，对比各水提液的挥发性成分和抗氧化性能，得到以下结论：己醇、1-辛烯-3-醇和己醛是大球盖菇水提液的重要成分，占总挥发性成分的75.02%~95.70%。超微粉碎对大球盖菇挥发性成分有破坏作用，粉碎粒度越细挥发性成分丧失越严重。P1条件下大球盖菇挥发性成分最强，与之对应的各处理条件排序为：超声>超高压>室温>均质>70 ℃>90 ℃。UT-P1条件下，大球盖菇水提液挥发性成分含量高、种类多。RT-P1条件下，大球盖菇水提液表现出最优的自由基清除能力，而90 ℃-P3得到的大球盖菇水提液铁离子还原能力最强。加工方法和粒径均对大球盖菇水提液的抗氧化能力有显著影响。本研究为大球盖菇在调味市场的精深加工提供参考。