从心论治方改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及上调ACE2 蛋白表达

顾毓艳，蒋 晶，张雅心，陈育尧，陈奕澔，江伟豪，黄志勇，周凤华

1南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；2南方医科大学第三附属医院耳鼻喉科，广东 广州 510630

心脑血管疾病目前已成为世界范围内的主要死亡原因，动脉粥样硬化（AS）是其主要病理基础［1］。内皮细胞功能障碍和损伤是粥样硬化病变的始动因素，肾素-血管紧张素系统（RAS）是心血管稳态的关键调节剂，在调节内皮细胞功能中具有重要作用［2］。血管紧张素转换酶2（ACE2）可将血管紧张素II（Ang Ⅱ）代谢为无活性的血管紧张素（1-7）（Ang（1-7））［3］。ACE2和Ang（1-7）能降低内皮细胞分泌的细胞黏附分子浓度，减轻AngⅡ诱导炎症反应，从而抑制AS 早期病变形成［4,5］，因此ACE2可能是防治AS性疾病的重要靶点［6］。

他汀类药物是目前AS临床治疗的一线用药，但其引起的肝肾损伤和肌肉溶解等副作用明显降低患者生存质量［7,8］。课题组前期发现，中药从心论治方（CXLZF）在体内可减轻小鼠高脂血症［9］，在体外能减轻ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞损伤［10］，但其是否能抗AS作用不清。因此，本研究拟采用高脂饮食（HFD）喂养ApoE-/-小鼠建立AS 模型，从ACE2 途径探讨CXLZF防治AS药理机制，为CXLZF临床应用提供必要的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性8周龄SPF级ApoE-/-小鼠30只和6只同周龄C57BL/6小鼠，体质量19～21 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXΚ（京）2016-0006。SPF级成年雄性SD大鼠30只，体质量约200 g，购于南方医科大学实验动物中心。饲养环境：SPF级，室温22～24 ℃，相对湿度为50%，12 h光/暗循环。本实验经南方医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物

CXLZF由黄连15 g（批号：HX18D01）、丹参15 g（批号：HX18D01）、酸枣仁20 g（批号：HX18F01）、灵芝10 g（批号：HX18D01）组成，全部药物购自南方医科大学南方医院。

1.3 动物模型及给药

小鼠适应性喂养1周后，以6只C57BL/6小鼠作为对照组，30 只ApoE-/-小鼠随机分为模型组（HFD）、CXLZF 低、中、高剂量组（CL、CM、CH）及辛伐他汀组（S），6只组。除对照组给予普通饲料外，其于组均给予高脂饲料。高脂饮食12周成功复制AS模型后［11］，分别给予CXLZF低、中、高剂量（4.5、9、18 g·kg-1·d-1）、辛伐他汀（5 mg·kg-1·d-1）灌胃，对照组、模型组以等体积生理盐水灌胃，1次/d，每周5 d，连续12周。末次给药后禁食12 h，给予10%水合氯醛麻醉小鼠后眼球取血、收集组织。

1.4 CXLZF含药血清制备

制备终质量浓度为2.31 g/mL的CXLZF水煎液；30只雄性SD大鼠随机分为实验组（n=20），对照组（n=10）；实验组大鼠每日早晚各灌胃2 mL CXLZF药液，对照组灌胃同体积生理盐水，连续7 d。末次灌胃1 h后，麻醉动物行腹主动脉取血，分离血清。灭菌后-20 ℃保存。

1.5 细胞培养、实验分组

人脐静脉内皮细胞（HUⅤECs，ZQ00446）购自上海中乔生物科技公司。采用含10%FBS的DMEM培养基，置于饱和湿度、5%CO2浓度及37 ℃恒温孵育箱中培养，细胞长满至培养皿80%～90%时，用0.25%胰酶消化传代，取对数增长期细胞进行实验。细胞分为：对照组（10%对照组大鼠血清）、模型组100 μg/m L 氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），CXLZF含药血清低中高剂量组（分别用5%，10%，20%含药血清孵育2 h，加入ox-LDL干预24 h）。

1.6 试剂及仪器

油红O（ORO）染色试剂盒、Masson染色试剂盒、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠ACE2 抗体、小鼠E-selection 抗体（Proteintech 中国公司）；小鼠血管紧张素（1-7）ELISA试剂盒（南京卡米洛生物工程有限公司）；荧光显微镜（广州市德真科技有限公司），化学发光法成像系统（广州誉维生物科技仪器有限公司）。

1.7 病理切片染色

收集小鼠主动脉根部、主动脉、肝脏制备切片。按照制造商指示方案进行ORO、Masson、苏木素伊红（HE）染色，封片后病理显微镜观察拍照。

1.8 葡萄糖、胰岛素耐受试验

在第24周，小鼠接受胰岛素耐受试验（ITT），禁食6 h后，以0.75 U/kg体质量腹腔注射胰岛素。分别检测胰岛素注射前（0 min）和胰岛素注射后15、30、60 和120 min时小鼠血糖。

1.9 ELISA

根据试剂盒说明书进行操作检测小鼠血清Ang（1-7）水平，步骤如下：在标准孔中加入标准品及小鼠血清（10倍稀释），37 ℃孵育60 min，洗涤后依次加入检测抗体Ang（1-7）、生物荧光色标记抗体、链霉亲和素HRP，分别在37 ℃孵育30 min。加入显色液避光显色15 min，终止液终止，450 nm波长检测吸光度。

1.10 Western blotting

采用RIPA裂解液（含10%PMSF）提取小鼠主动脉蛋白，BCA法测定蛋白浓度。60μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离后转膜，采用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，采用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗（ACE2、E-selection，1∶500）4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3×5 min，辣根过氧化酶标记二抗（1∶3000）室温孵育1 h，TBST洗膜3×5 min。ECL法发光显色，Image J软件分析。

1.11 免疫荧光

冰冻切片采用多聚甲醛固定15 min，0.25%Triton X-100 通透10 min，10 %山羊血清封闭1 h 后，一抗（ACE2，1∶250）4 ℃孵育过夜；再用DyLight 549 荧光二抗（1∶400）室温避光孵育2 h，采用DAPI 染色10 min，以防荧光淬灭剂封片。切片在荧光显微镜下观察拍照。

1.12 统计学方法

采用SPSS 22软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。若符合正态分布和方差齐性，使用单因素方差分析和T检验。方差不齐时，使用Welch方差分析和Welch校正T检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXLZF减轻AS小鼠主动脉斑块损伤

与对照组相比，模型组小鼠有明显AS斑块形成（图1）。CXLZF干预后显著减小斑块面积，其中高剂量组效果更显著。CXLZF组与辛伐他汀组相比无显著差异。此外，CXLZF可增加AS斑块胶原纤维含量（图2），提示斑块更稳定。结果表明，CXLZF可显著减轻AS斑块损伤。

图1 主动脉窦ORO染色Fig.1 Oil red O staining of the aortic root in different groups(Original magnification:×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

图2 主动脉窦Masson染色Fig.2 Masson staining of the aortic root in different groups (×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

HE染色显示（图3），与对照组相比，模型组主动脉厚薄不均，内皮下可见有沉着的脂滴及泡沫状细胞，动脉壁结构破坏，弹力纤维断裂，平滑肌数量减少，CXLZF能改善AS小鼠主动脉病理改变。

图3 主动脉HE染色Fig.3 HE staining of the aortic tissue in different groups (×100).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

2.2 CXLZF 改善AS小鼠血糖和血脂

ITT结果显示（表1），与对照组相比，模型组血糖浓度明显升高（P＜0.05），CXLZF可降低血糖，在胰岛素注射第120 min时高剂量作用明显（P＜0.05）。

表1 小鼠ITT结果Tab.1 Results of ITT in mice(Mean±SD,n=6)

与对照组相比，模型组体质量显著增加（P＜0.01），而CXLZF可明显抑制小鼠体质量增长，中、高剂量组效果最佳（P＜0.01，表2）。此外，与对照组相比，模型组小鼠TG、TC、LDL-C浓度分别增加5.03、7.72、3.06倍（P＜0.05），HDL-C浓度下降无统计学意义（P＞0.05）。CXLZF能显著降低小鼠TG、TC、LDL-C浓度（P＜0.05），且呈剂量依赖性改变。

表2 小鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels of the mice(Mean±SD,n=6)

2.3 CXLZF改善AS小鼠肝损伤

肝脏病理染色显示（图4），与对照组相比，模型组肝索排列紊乱，大量肝细胞严重脂肪变性，细胞结构模糊，胞核固缩或碎裂，坏死区和肝窦内可见大量炎细胞浸润。CXLZF及辛伐他汀均能显著减轻肝脏脂肪样性及炎性细胞浸润。ORO结果显示（图5），与对照组相比，模型组脂质沉积明显，CXLZF干预能显著减少肝脏脂质沉积。

图4 肝脏HE染色Fig.4 HE staining of the liver tissue in different groups (×200).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

图5 肝脏ORO染色Fig.5 Oil red O staining of the liver tissue in different groups (×400).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

与模型组相比，CXLZF 组小鼠肝脏指数降低（P＜0.05）。此外，模型组血清ALT、AST浓度显著高于对照组（P＜0.01），CXLZF 和辛伐他汀均可明显降低ALT、AST水平（P＜0.05）。由此可见，CXLZF可有效改善HFD诱导肝脏损伤（表3）。

表3 小鼠肝功指标Tab.3 Index of liver function of the mice(Mean±SD,n=6)

2.4 CXLZF可上调AS小鼠ACE2表达

如图6A所示，与对照组相比，模型组小鼠ACE2明显降低（0.64倍，P＜0.05），CXLZF可上调ACE2蛋白水平，高剂量作用最为明显（2.27 倍，P＜0.05）；此外，CXLZF还可降低E-selectin浓度（P＜0.05）。

免疫荧光显示（图7），在AS斑块内，ACE2蛋白表达主要位于胞浆。与模型组相比，CXLZF组斑块胞浆内红色荧光显著增加，提示中药可上调ACE2蛋白表达。ELISA结果显示（图6B），CXLZF可上调AS小鼠血清Ang（1-7）浓度，但结果无统计学意义。

图6 各组主动脉ACE2、E-selectin，血清Ang（1-7）水平Fig.6 Protein expressions of ACE2,E-selectin and Ang (1-7) in different groups.HFD:Model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:Medium-CXLZF dose group,CH:High-CXLZF dose group.#P＜0.05;*P＜0.05 vs model group.

图7 主动脉斑块ACE2免疫荧光染色Fig.7 Immunofluorescence staining ofACE2 in the aortic root in different groups(×200).

2.5 CXLZF 上调ox-LDL 干预HUⅤEC 细胞的ACE2表达

如图8A所示，与对照组相比，模型组HUⅤEC细胞中ACE2蛋白表达明显降低（0.83倍，P＜0.05），CXLZF可上调ACE2蛋白水平，中剂量作用最为明显（2.27倍，P＜0.05）；此外，CXLZF含药血清干预可显著上调ox-LDL干预引起Ang基因表达量下降（图8B，P＜0.05）。

图8 CXLZF上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞的ACE2表达Fig.8 CXLZF up-regulates the protein of ACE2 (A) and the mRNA of Ang (B) expression in HUVECs.ox-LDL:model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:medium-CXLZF dose group,CH:high-CXLZF dose group.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs model group.

3 讨论

本研究旨在探讨CXLZF对高脂喂养ApoE-/-小鼠AS损伤的影响及机制。我们发现，CXLZF可明显减轻小鼠斑块损伤，改善小鼠血糖血脂水平及肝脏脂肪变性。在RAS系统中，CXLZF可增加主动脉ACE2蛋白含量，减少黏附分子表达。我们推测，ACE2可能是CXLZF改善小鼠AS损伤的靶点之一。

CXLZF由黄连、丹参、酸枣仁、灵芝组成，来源于南方医院中医科治疗冠心病的经验方定心方。AS的中医辨证实为痰湿瘀毒互结之证，治则以祛湿解毒活血为要，CXLZF君药为入中焦脾胃肝胆经之黄连，取其清热祛湿解毒功效，臣以入心、肝经之丹参活血化瘀消痈，佐以酸枣仁养心补肝，宁心安神。以灵芝滋补强壮为使药，缓和君药黄连之苦寒。四味药材共奏清热祛湿、活血解毒、扶正益气之功效。前期研究发现，CXLZF在体内可改善小鼠高脂血症［10］，在体外能减轻ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞损伤［10］。

ApoE是血液中脂蛋白的重要组分，在胆固醇和脂蛋白代谢调节中起主要作用，ApoE基因敲除小鼠可自发形成AS，且在病理及组织学形态上与人类极其相近，HFD喂养的ApoE-/-小鼠是目前研究AS的常用动物模型之一［12,13］。HFD喂养ApoE-/-小鼠后可诱导血管内皮细胞激活，促进单核细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质形成泡沫细胞。泡沫细胞在动脉内膜中堆积形成脂质斑块［14,15］，斑块面积可反映AS 损伤程度。我们发现，CXLZF可减小ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积。此外，斑块稳定性也是评估AS损伤程度的重要指标［16,17］，胶原纤维含量越多，斑块越稳定。与模型组相比，CXLZF显著增加斑块中胶原纤维含量。提示CXLZF能显著减轻AS损伤，其作用可能与方中主要成分黄连素、丹参酮ⅡA和灵芝多糖等有关。已有研究表明，以上活性成分均具有改善AS斑块损伤作用［16,17］。

AS与脂质代谢紊乱密切相关，血脂升高是AS发病的重要危险因素［17］。其中，低密度脂蛋白能增加动脉壁胆固醇内流和沉积，促进AS形成，高密度脂蛋白能通过抑制固醇内流和沉积阻止AS发生发展［21］。本研究发现，CXLZF可明显改善AS小鼠血脂水平，包括降低TC、TG、LDL-C，但对HDL-C调节作用不明显。血糖升高也是AS发病的重要危险因素，CXLZF能改善AS小鼠血糖，可能主要与君药黄连降糖作用有关［21-23］。可见，CXLZF能有效调节AS小鼠血糖血脂水平，延缓AS进展。

HFD诱导肝脏脂质积累能加重小鼠AS损伤［24,25］。本研究中，高脂喂养24周后ApoE-/-小鼠肝脏出现明显脂肪变性，ALT与AST水平显著升高，而CXLZF能显著改善小鼠肝脏损伤。提示CXLZF抗AS损伤可能主要与减轻HFD诱导的斑块形成及肝脏病变有关。

内皮细胞功能障碍是AS病变的始动因素，RAS在内皮细胞功能调节中具有重要作用，其主要成员ACE2可通过改善内皮功能、局部炎症、脂质沉积等抗AS损伤［26,27］。我们发现，CXLZF可显著上调AS小鼠主动脉ACE2蛋白表达，同时，CXLZF含药血清可上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞的ACE2蛋白表达，ACE2增加可下调E-selectin蛋白水平，其是炎症早期出现的黏附分子，也是血管内皮细胞受损的标志［28-30］。此外，ACE2可上调Ang（1-7）水平，其可通过保护血管内皮细胞、减轻炎症反应及氧化应激等发挥抗动脉粥样硬化作用［28,31-34］。本实验中，CXLZF可使AS小鼠血清中Ang（1-7）含量呈增长趋势，CXLZF含药血清可上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞中Ang基因表达。因此我们推测，CXLZF可能通过ACE2蛋白调节RAS系统、减少黏附分子表达，从而减轻AS损伤。

综上所述，中药CXLZF能有效减轻HFD诱导的ApoE-/-小鼠AS损伤，改善小鼠血糖血脂水平及肝功能，机制可能与调节ACE2蛋白表达有关，但如何调控还需进一步研究。