顾毓艳,蒋 晶,张雅心,陈育尧,陈奕澔,江伟豪,黄志勇,周凤华
1南方医科大学中医药学院,广东 广州 510515;2南方医科大学第三附属医院耳鼻喉科,广东 广州 510630
心脑血管疾病目前已成为世界范围内的主要死亡原因,动脉粥样硬化(AS)是其主要病理基础[1]。内皮细胞功能障碍和损伤是粥样硬化病变的始动因素,肾素-血管紧张素系统(RAS)是心血管稳态的关键调节剂,在调节内皮细胞功能中具有重要作用[2]。血管紧张素转换酶2(ACE2)可将血管紧张素II(Ang Ⅱ)代谢为无活性的血管紧张素(1-7)(Ang(1-7))[3]。ACE2和Ang(1-7)能降低内皮细胞分泌的细胞黏附分子浓度,减轻AngⅡ诱导炎症反应,从而抑制AS 早期病变形成[4,5],因此ACE2可能是防治AS性疾病的重要靶点[6]。
他汀类药物是目前AS临床治疗的一线用药,但其引起的肝肾损伤和肌肉溶解等副作用明显降低患者生存质量[7,8]。课题组前期发现,中药从心论治方(CXLZF)在体内可减轻小鼠高脂血症[9],在体外能减轻ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[10],但其是否能抗AS作用不清。因此,本研究拟采用高脂饮食(HFD)喂养ApoE-/-小鼠建立AS 模型,从ACE2 途径探讨CXLZF防治AS药理机制,为CXLZF临床应用提供必要的实验依据。
健康雄性8周龄SPF级ApoE-/-小鼠30只和6只同周龄C57BL/6小鼠,体质量19~21 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXΚ(京)2016-0006。SPF级成年雄性SD大鼠30只,体质量约200 g,购于南方医科大学实验动物中心。饲养环境:SPF级,室温22~24 ℃,相对湿度为50%,12 h光/暗循环。本实验经南方医科大学实验动物伦理委员会批准。
CXLZF由黄连15 g(批号:HX18D01)、丹参15 g(批号:HX18D01)、酸枣仁20 g(批号:HX18F01)、灵芝10 g(批号:HX18D01)组成,全部药物购自南方医科大学南方医院。
小鼠适应性喂养1周后,以6只C57BL/6小鼠作为对照组,30 只ApoE-/-小鼠随机分为模型组(HFD)、CXLZF 低、中、高剂量组(CL、CM、CH)及辛伐他汀组(S),6只组。除对照组给予普通饲料外,其于组均给予高脂饲料。高脂饮食12周成功复制AS模型后[11],分别给予CXLZF低、中、高剂量(4.5、9、18 g·kg-1·d-1)、辛伐他汀(5 mg·kg-1·d-1)灌胃,对照组、模型组以等体积生理盐水灌胃,1次/d,每周5 d,连续12周。末次给药后禁食12 h,给予10%水合氯醛麻醉小鼠后眼球取血、收集组织。
制备终质量浓度为2.31 g/mL的CXLZF水煎液;30只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=20),对照组(n=10);实验组大鼠每日早晚各灌胃2 mL CXLZF药液,对照组灌胃同体积生理盐水,连续7 d。末次灌胃1 h后,麻醉动物行腹主动脉取血,分离血清。灭菌后-20 ℃保存。
人脐静脉内皮细胞(HUⅤECs,ZQ00446)购自上海中乔生物科技公司。采用含10%FBS的DMEM培养基,置于饱和湿度、5%CO2浓度及37 ℃恒温孵育箱中培养,细胞长满至培养皿80%~90%时,用0.25%胰酶消化传代,取对数增长期细胞进行实验。细胞分为:对照组(10%对照组大鼠血清)、模型组100 μg/m L 氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),CXLZF含药血清低中高剂量组(分别用5%,10%,20%含药血清孵育2 h,加入ox-LDL干预24 h)。
油红O(ORO)染色试剂盒、Masson染色试剂盒、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);小鼠ACE2 抗体、小鼠E-selection 抗体(Proteintech 中国公司);小鼠血管紧张素(1-7)ELISA试剂盒(南京卡米洛生物工程有限公司);荧光显微镜(广州市德真科技有限公司),化学发光法成像系统(广州誉维生物科技仪器有限公司)。
收集小鼠主动脉根部、主动脉、肝脏制备切片。按照制造商指示方案进行ORO、Masson、苏木素伊红(HE)染色,封片后病理显微镜观察拍照。
在第24周,小鼠接受胰岛素耐受试验(ITT),禁食6 h后,以0.75 U/kg体质量腹腔注射胰岛素。分别检测胰岛素注射前(0 min)和胰岛素注射后15、30、60 和120 min时小鼠血糖。
根据试剂盒说明书进行操作检测小鼠血清Ang(1-7)水平,步骤如下:在标准孔中加入标准品及小鼠血清(10倍稀释),37 ℃孵育60 min,洗涤后依次加入检测抗体Ang(1-7)、生物荧光色标记抗体、链霉亲和素HRP,分别在37 ℃孵育30 min。加入显色液避光显色15 min,终止液终止,450 nm波长检测吸光度。
采用RIPA裂解液(含10%PMSF)提取小鼠主动脉蛋白,BCA法测定蛋白浓度。60μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离后转膜,采用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,采用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,一抗(ACE2、E-selection,1∶500)4 ℃孵育过夜;TBST洗膜3×5 min,辣根过氧化酶标记二抗(1∶3000)室温孵育1 h,TBST洗膜3×5 min。ECL法发光显色,Image J软件分析。
冰冻切片采用多聚甲醛固定15 min,0.25%Triton X-100 通透10 min,10 %山羊血清封闭1 h 后,一抗(ACE2,1∶250)4 ℃孵育过夜;再用DyLight 549 荧光二抗(1∶400)室温避光孵育2 h,采用DAPI 染色10 min,以防荧光淬灭剂封片。切片在荧光显微镜下观察拍照。
采用SPSS 22软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示。若符合正态分布和方差齐性,使用单因素方差分析和T检验。方差不齐时,使用Welch方差分析和Welch校正T检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
与对照组相比,模型组小鼠有明显AS斑块形成(图1)。CXLZF干预后显著减小斑块面积,其中高剂量组效果更显著。CXLZF组与辛伐他汀组相比无显著差异。此外,CXLZF可增加AS斑块胶原纤维含量(图2),提示斑块更稳定。结果表明,CXLZF可显著减轻AS斑块损伤。
图1 主动脉窦ORO染色Fig.1 Oil red O staining of the aortic root in different groups(Original magnification:×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.
图2 主动脉窦Masson染色Fig.2 Masson staining of the aortic root in different groups (×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.
HE染色显示(图3),与对照组相比,模型组主动脉厚薄不均,内皮下可见有沉着的脂滴及泡沫状细胞,动脉壁结构破坏,弹力纤维断裂,平滑肌数量减少,CXLZF能改善AS小鼠主动脉病理改变。
图3 主动脉HE染色Fig.3 HE staining of the aortic tissue in different groups (×100).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.
ITT结果显示(表1),与对照组相比,模型组血糖浓度明显升高(P<0.05),CXLZF可降低血糖,在胰岛素注射第120 min时高剂量作用明显(P<0.05)。
表1 小鼠ITT结果Tab.1 Results of ITT in mice(Mean±SD,n=6)
与对照组相比,模型组体质量显著增加(P<0.01),而CXLZF可明显抑制小鼠体质量增长,中、高剂量组效果最佳(P<0.01,表2)。此外,与对照组相比,模型组小鼠TG、TC、LDL-C浓度分别增加5.03、7.72、3.06倍(P<0.05),HDL-C浓度下降无统计学意义(P>0.05)。CXLZF能显著降低小鼠TG、TC、LDL-C浓度(P<0.05),且呈剂量依赖性改变。
表2 小鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels of the mice(Mean±SD,n=6)
肝脏病理染色显示(图4),与对照组相比,模型组肝索排列紊乱,大量肝细胞严重脂肪变性,细胞结构模糊,胞核固缩或碎裂,坏死区和肝窦内可见大量炎细胞浸润。CXLZF及辛伐他汀均能显著减轻肝脏脂肪样性及炎性细胞浸润。ORO结果显示(图5),与对照组相比,模型组脂质沉积明显,CXLZF干预能显著减少肝脏脂质沉积。
图4 肝脏HE染色Fig.4 HE staining of the liver tissue in different groups (×200).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.
图5 肝脏ORO染色Fig.5 Oil red O staining of the liver tissue in different groups (×400).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.
与模型组相比,CXLZF 组小鼠肝脏指数降低(P<0.05)。此外,模型组血清ALT、AST浓度显著高于对照组(P<0.01),CXLZF 和辛伐他汀均可明显降低ALT、AST水平(P<0.05)。由此可见,CXLZF可有效改善HFD诱导肝脏损伤(表3)。
表3 小鼠肝功指标Tab.3 Index of liver function of the mice(Mean±SD,n=6)
如图6A所示,与对照组相比,模型组小鼠ACE2明显降低(0.64倍,P<0.05),CXLZF可上调ACE2蛋白水平,高剂量作用最为明显(2.27 倍,P<0.05);此外,CXLZF还可降低E-selectin浓度(P<0.05)。
免疫荧光显示(图7),在AS斑块内,ACE2蛋白表达主要位于胞浆。与模型组相比,CXLZF组斑块胞浆内红色荧光显著增加,提示中药可上调ACE2蛋白表达。ELISA结果显示(图6B),CXLZF可上调AS小鼠血清Ang(1-7)浓度,但结果无统计学意义。
图6 各组主动脉ACE2、E-selectin,血清Ang(1-7)水平Fig.6 Protein expressions of ACE2,E-selectin and Ang (1-7) in different groups.HFD:Model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:Medium-CXLZF dose group,CH:High-CXLZF dose group.#P<0.05;*P<0.05 vs model group.
图7 主动脉斑块ACE2免疫荧光染色Fig.7 Immunofluorescence staining ofACE2 in the aortic root in different groups(×200).
如图8A所示,与对照组相比,模型组HUⅤEC细胞中ACE2蛋白表达明显降低(0.83倍,P<0.05),CXLZF可上调ACE2蛋白水平,中剂量作用最为明显(2.27倍,P<0.05);此外,CXLZF含药血清干预可显著上调ox-LDL干预引起Ang基因表达量下降(图8B,P<0.05)。
图8 CXLZF上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞的ACE2表达Fig.8 CXLZF up-regulates the protein of ACE2 (A) and the mRNA of Ang (B) expression in HUVECs.ox-LDL:model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:medium-CXLZF dose group,CH:high-CXLZF dose group.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.
本研究旨在探讨CXLZF对高脂喂养ApoE-/-小鼠AS损伤的影响及机制。我们发现,CXLZF可明显减轻小鼠斑块损伤,改善小鼠血糖血脂水平及肝脏脂肪变性。在RAS系统中,CXLZF可增加主动脉ACE2蛋白含量,减少黏附分子表达。我们推测,ACE2可能是CXLZF改善小鼠AS损伤的靶点之一。
CXLZF由黄连、丹参、酸枣仁、灵芝组成,来源于南方医院中医科治疗冠心病的经验方定心方。AS的中医辨证实为痰湿瘀毒互结之证,治则以祛湿解毒活血为要,CXLZF君药为入中焦脾胃肝胆经之黄连,取其清热祛湿解毒功效,臣以入心、肝经之丹参活血化瘀消痈,佐以酸枣仁养心补肝,宁心安神。以灵芝滋补强壮为使药,缓和君药黄连之苦寒。四味药材共奏清热祛湿、活血解毒、扶正益气之功效。前期研究发现,CXLZF在体内可改善小鼠高脂血症[10],在体外能减轻ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[10]。
ApoE是血液中脂蛋白的重要组分,在胆固醇和脂蛋白代谢调节中起主要作用,ApoE基因敲除小鼠可自发形成AS,且在病理及组织学形态上与人类极其相近,HFD喂养的ApoE-/-小鼠是目前研究AS的常用动物模型之一[12,13]。HFD喂养ApoE-/-小鼠后可诱导血管内皮细胞激活,促进单核细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质形成泡沫细胞。泡沫细胞在动脉内膜中堆积形成脂质斑块[14,15],斑块面积可反映AS 损伤程度。我们发现,CXLZF可减小ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积。此外,斑块稳定性也是评估AS损伤程度的重要指标[16,17],胶原纤维含量越多,斑块越稳定。与模型组相比,CXLZF显著增加斑块中胶原纤维含量。提示CXLZF能显著减轻AS损伤,其作用可能与方中主要成分黄连素、丹参酮ⅡA和灵芝多糖等有关。已有研究表明,以上活性成分均具有改善AS斑块损伤作用[16,17]。
AS与脂质代谢紊乱密切相关,血脂升高是AS发病的重要危险因素[17]。其中,低密度脂蛋白能增加动脉壁胆固醇内流和沉积,促进AS形成,高密度脂蛋白能通过抑制固醇内流和沉积阻止AS发生发展[21]。本研究发现,CXLZF可明显改善AS小鼠血脂水平,包括降低TC、TG、LDL-C,但对HDL-C调节作用不明显。血糖升高也是AS发病的重要危险因素,CXLZF能改善AS小鼠血糖,可能主要与君药黄连降糖作用有关[21-23]。可见,CXLZF能有效调节AS小鼠血糖血脂水平,延缓AS进展。
HFD诱导肝脏脂质积累能加重小鼠AS损伤[24,25]。本研究中,高脂喂养24周后ApoE-/-小鼠肝脏出现明显脂肪变性,ALT与AST水平显著升高,而CXLZF能显著改善小鼠肝脏损伤。提示CXLZF抗AS损伤可能主要与减轻HFD诱导的斑块形成及肝脏病变有关。
内皮细胞功能障碍是AS病变的始动因素,RAS在内皮细胞功能调节中具有重要作用,其主要成员ACE2可通过改善内皮功能、局部炎症、脂质沉积等抗AS损伤[26,27]。我们发现,CXLZF可显著上调AS小鼠主动脉ACE2蛋白表达,同时,CXLZF含药血清可上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞的ACE2蛋白表达,ACE2增加可下调E-selectin蛋白水平,其是炎症早期出现的黏附分子,也是血管内皮细胞受损的标志[28-30]。此外,ACE2可上调Ang(1-7)水平,其可通过保护血管内皮细胞、减轻炎症反应及氧化应激等发挥抗动脉粥样硬化作用[28,31-34]。本实验中,CXLZF可使AS小鼠血清中Ang(1-7)含量呈增长趋势,CXLZF含药血清可上调ox-LDL干预HUⅤEC细胞中Ang基因表达。因此我们推测,CXLZF可能通过ACE2蛋白调节RAS系统、减少黏附分子表达,从而减轻AS损伤。
综上所述,中药CXLZF能有效减轻HFD诱导的ApoE-/-小鼠AS损伤,改善小鼠血糖血脂水平及肝功能,机制可能与调节ACE2蛋白表达有关,但如何调控还需进一步研究。