大鼠帕金森病模型中α-突触核蛋白对干扰素调节因子1 的调控及其机制

牟斐斐，陈 曦，杜希恂，焦 倩，毕明霞，姜 宏

青岛大学国家生理学重点（培育）学科，山东 青岛 266071

帕金森病（PD）是一种多发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓、姿势反射障碍等［1-3］。PD的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元选择性缺失，残存的神经元内出现以α-突触核蛋白（α-Syn）聚集为主形成的路易小体［4,5］。PD的病因尚未完全阐明，越来越多的证据表明，免疫炎症反应参与了PD的神经退变［6,7］。1988年，McGeer等［9］在PD患者的尸检标本中首次观察到黑质区存在大量激活的小胶质细胞［8］，并且PD患者脑脊液和血清中促炎因子水平升高。深入探讨免疫炎症在PD神经退变中的作用，已成为PD研究的热点。

神经炎症的发生往往是细胞内蛋白异常聚集的结果，如α-Syn、amyloid-β等［10］。α-Syn可激活小胶质细胞，引起炎性因子分泌增加［11,12］。此外，α-Syn纤维聚集体以依赖Caspase-1的方式增加单核细胞和小胶质细胞白介素1β（IL-1β）的释放，触发NLRP3炎性小体的激活［13］。免疫细胞的激活又会进一步促进α-Syn经囊泡的摄取，如此形成恶性循环，加剧多巴胺能神经元的损伤［14］。α-Syn的两个抗原表位（Y39和S129）可由主要组织相容性复合体Ⅰ（MHC Ⅰ）呈递给T淋巴细胞，诱导免疫应答，提示PD是一种自身免疫性疾病［15］。但是，PD中α-Syn诱发神经免疫炎症反应的分子机制尚未完全阐明。

干扰素调节因子1（IRF-1）是一种多功能转录因子，在抗病毒感染、调节机体免疫等方面发挥重要作用［16］。当细胞受到炎性刺激后，IRF-1会发生磷酸化和二聚化而被激活，通过与干扰素调节因子结合元件（IRF-E）结合，参与免疫应答［17,18］。IRF-1已被证实与缺血性脑损伤、急性白血病、食管癌、胃癌等多种疾病有关［18］，然而其在神经退行性疾病，比如PD中的作用却未见报道。IRF-1是否通过调控免疫炎症反应，进而参与PD发生的呢？IRF-1的表达受到泛素-蛋白酶体系统的调控，MDM2作为IRF-1的E3泛素连接酶，参与调控其蛋白稳定性［19］。研究PD中IRF-1表达调控的分子机制，将为阐明神经免疫反应参与PD神经退变提供依据。

本研究选用α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞以及携带人A53T突变型α-Syn的转基因小鼠，应用real-time PCR和western blot技术检测IRF-1表达的变化，免疫荧光染色和核浆蛋白分离技术观察IRF-1亚细胞定位情况。SH-SY5Y 细胞给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹处理，检测细胞存活率的变化。选用不引起损伤的最大浓度MG132和氯喹处理SH-SY5Y细胞，检测IRF-1蛋白表达的变化。最后，观察α-Syn过表达对MDM2及其介导的IRF-1泛素化水平的影响。本研究在PD模型中深入探讨α-Syn对IRF-1表达的影响及其调控机制，揭示α-Syn触发神经免疫炎症反应的分子机制及其在PD神经退行性病变中的作用，通过调控中枢免疫炎症反应以减轻神经退变，有望为PD治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

MEM、F12 培养基、胎牛血清（Gibco），IRF-1、MDM2 抗体（Abcam），β-actin、β-tubulin、MAX 抗体（CST），Myc、HA标签抗体（MBL），lipofectamine 2000、荧光二抗、DAPI染色液（Invitrogen），SYBR Green染料（Takara），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（Absin），MG32、氯喹（APExBIO），MTT（Sigma）。

1.2 SH-SY5Y细胞培养

多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。培养于含10%胎牛血清的MEM+F12完全培养基中，置于CO2细胞培养箱（37 ℃，5%CO2）中培养。

1.3 SH-SY5Y细胞转染

构建WT α-Syn和A53T α-Syn过表达载体，实验分组：空载组、WT α-Syn 过表达组、A53T α-Syn 过表达组。将SH-SY5Y细胞以1×105/mL密度接种6孔板，待细胞生长至80%～90%融合，DNA（μg）：lipofectamine 2000（μL）按照1∶2.5比例混合，室温静止20 min。加入新的无血清无抗生素培养基，然后将DNA-脂质体复合物逐滴加入。将细胞放入CO2培养箱中培养4 h后弃去含DNA-脂质体复合物的培养基，换成含血清抗生素的完全培养基继续培养24 h。

1.4 A53T α-Syn转基因小鼠基因型鉴定

2月龄携带人A53T突变型α-Syn的纯合子转基因小鼠[B6;C3-Tg（Prnp-SNCA*A53T）83Ⅴle/J]雌雄各2只购于美国Jackson Laboratory，置于恒湿（50%±10%）、恒温（21±2 ℃）、昼夜循环光照（12～12 h）环境下生活，自由饮水、取食。待新生鼠饲养至1月龄，取小鼠鼠尾加入500 μL裂解液，恒温箱中55 ℃过夜，涡旋至鼠尾完全裂解，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取350 μL上清液加入等体积的异丙醇充分振荡。4 ℃，12 000 r/min离心10min，弃掉液体干燥。应用实时荧光定量PCR技术根据△Ct值鉴定基因型。实验分组：3月龄和6月龄A53T α-Syn纯合子小鼠各6只以及同窝野生型小鼠各6只。

1.5 实时荧光定量PCR检测IRF-1 mRNA水平

实验分组：空载组、WT α-Syn过表达组、A53T α-Syn过表达组。提取细胞总RNA后，取5μg RNA加入20 μL反应体系中进行逆转录，应用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR实验。IRF-1上游引物序列：5'-AAAGTCGAAGTCCAGCCGAG-3'；下游引物序列：5'-CAGAGTGGAGCTGCTGAGTC-3'，GAPDH上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；下游引物序列：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR反应条件：预变性95 ℃30 s；变性95 ℃5 s，退火、延伸60 ℃30 s，40个循环。应用2-△△Ct相对定量法计算IRF-1基因表达。

1.6 Western blot检测IRF-1和MDM2蛋白表达水平

细胞实验分组：空载组、WT α-Syn过表达组、A53T α-Syn过表达组。动物实验分组：3月龄和6月龄A53T α-Syn纯合子小鼠各6只以及同窝野生型小鼠各6只。提取细胞或组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，加入5×loading buffer混匀，100 ℃水浴5 min。取20 μg蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到PⅤDF膜上，10%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应的一抗（IRF-1，1∶1000；MDM2，1∶1000；β-tubulin，1∶10 000；β-actin，1∶10 000；MAX，1∶10 000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST溶液漂洗10 min×3 次，加入二抗（goat anti-rabbit IgG-HRP，1∶10 000；goat anti-mouse IgG-HRP，1∶10 000），放置摇床室温1 h，TBST溶液漂洗10 min×3次。ECL化学发光液显影，UⅤP凝胶成像后条带用Image J软件分析。

1.7 免疫荧光技术检测IRF-1亚细胞定位

实验分组：空载组、WT α-Syn过表达组、A53T α-Syn过表达组。将细胞4%多聚甲醛室温固定30 min后，加入10%山羊血清室温封闭1 h，去除封闭液，加入IRF-1一抗，4 ℃孵育过夜，PBS溶液漂洗5 min×3次，加入荧光标记羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，加入DAPI室温孵育10 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，甘油封片，使用激光共聚焦扫描显微镜拍摄荧光图像。

1.8 MTT方法检测细胞存活率

实验分组：0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μmol MG132处理组和0、5、10、30、50、100、150、200 μmol氯喹处理组。将SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的MG132和氯喹处理24 h后，每孔加入20 μLMTT，置于培养箱中培养4 h，加入100 μL DMSO振荡混匀后，应用酶标仪检测494 nm和630 nm波长吸光度值，细胞存活率=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.9 泛素化实验检测IRF-1泛素化水平

实验分组：Myc-IRF-1+Flag-空载+HA-空载、Myc-IRF-1+Flag-空载+HA-Ub、Myc-IRF-1+Flag-WTα-Syn+HA-Ub、Myc-IRF-1+Flag-A53Tα-Syn+HA-Ub。细胞转染相应质粒后加入蛋白酶体抑制剂MG132（20 μmol/L），8 h 后收集细胞，4 ℃，3000 r/min，离心5 min，弃上清，置于冰上。加入400 μL HEPES裂解液重悬，超声裂解，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min。取40 μL上清液加入2×loading buffer，100 ℃水浴5 min，检测细胞内蛋白的表达。剩下的360 μL上清液加入2 μLMyc标签抗体，4 ℃旋转4～6 h。加入40～60 μL protein A/G PLUS-Agarose，4 ℃旋转8～10 h，4 ℃，3000 r/min，离心3 min，弃掉960 μL上清液，剩余40 μL加入2×loading buffer混匀，100℃水浴10min。孵育相应抗体进行免疫印迹实验。

1.10 统计学处理

实验结果均采用均数±标准差表示，应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组以上均数的比较采用单因素方差分析（One-wayANOⅤA），继以Student-Newman-Κeuls法进行两两比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 α-Syn过表达导致IRF-1蛋白水平升高

WT α-Syn和A53T α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞中，IRF-1 mRNA水平无显著差异（图1A），而IRF-1的蛋白水平升高，与空载组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01，图1B，C）。3月龄和6月龄小鼠黑质区IRF-1的蛋白水平明显升高，与同窝野生型小鼠相比，差异具有统计学意义（P＜0.001，图1D，E）。

图1 α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞以及A53T α-Syn转基因小鼠黑质区IRF-1表达的变化Fig.1 Changes of IRF-1 expression in α-Syn-overexpressing SH-SY5Y cells and A53T α-Syn transgenic mice.A:Real-time PCR was applied for detecting IRF-1 mRNA levels in wild-type(WT)α-Syn or A53T α-Syn-overexpressing SH-SY5Y cells.Western blotting was used to examine IRF-1 protein levels in WT α-Syn or A53T α-Syn overexpressing SH-SY5Y cells(B,C)and in the SN of 3-and 6-month-old A53T α-Syn transgenic mice(D,E).Data ware presented as the ratio of IRF-1 to βtubulin.**P＜0.01,***P＜0.001 vs control;##P＜0.01 vs WT α-Syn group;^^^P＜0.001 vs WT group.n=6.

2.2 α-Syn过表达促进IRF-1核移位

免疫荧光结果显示，空载组中IRF-1蛋白主要定位于胞浆中，WT α-Syn和A53T α-Syn过表达组IRF-1在胞核的比例升高，差异具有统计学意义（P＜0.001，图2A，B）。WT α-Syn和A53T α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞中，IRF-1在胞核的蛋白水平升高，与空载组相比，差异具有统计学意义（P＜0.001，图2C，D）。

图2 α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞中IRF-1亚细胞定位的变化Fig.2 Subcellular distribution of IRF-1 in α-Syn-overexpressing SH-SY5Y cells.A:Subcellular localization of IRF-1 in WT α-Syn or A53T α-Syn overexpressing SH-SY5Y cells determined by immunofluorescence assay.SH-SY5Y cells were stained with anti-α-Syn(green)and anti-IRF-1(red)and cell nuclei were counterstained with DAPI(blue).Scale bar=20 μm.B:Quantification of cells with IRF-1 fluorescence labeling.***P＜0.001 vs cytoplasm and nucleus in control group;###P＜0.001 vs nucleus in control group.C,D:Cytoplasmic and nuclear protein were isolated to detect the expression of IRF-1 in cytoplasm and nuclei by western blotting.A cytoplasmic marker β-tubulin and a nuclear marker MAX were used as the internal control.^^^P＜0.001 vs nuclear protein in control group.n=6.

2.3 MG132和氯喹对SH-SY5Y细胞存活率的影响

不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132（0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μmol/L）以及溶酶体抑制剂氯喹（0、5、10、30、50、100、150、200 μmol/L）处理SH-SY5Y 细胞24 h，MTT结果显示，细胞存活率随MG132（图3A）和氯喹（图3B）浓度升高逐渐降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。选用不引起细胞损伤的最大浓度（0.2 μmol/L MG132和30 μmol/L氯喹）进行后续实验。

图3 不同浓度MG-132或氯喹处理对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of MG132 or chloroquine on the viability of SH-SY5Y cells.Cell viability was determined by MTT assay in SH-SY5Y cells treated with different doses of MG132(A)or chloroquine(B)for 24 h.**P＜0.01,***P＜0.001 vs control.n=6.

2.4 α-Syn通过泛素-蛋白酶体途径调控IRF-1蛋白表达

0.2μmol/L MG132处理SH-SY5Y细胞24 h后可显著加剧α-Syn对IRF-1蛋白表达的上调作用，与单独过表达WT α-Syn和A53T α-Syn组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01，图4A），而30 μmo/L氯喹处理SH-SY5Y细胞24h后IRF-1的蛋白水平无显著变化（P＞0.05，图4B）。

图4 α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞经MG132或氯喹处理对IRF-1蛋白表达的影响Fig.4 Effects of MG132 or chloroquine on IRF-1 protein levels in α-Syn-overexpressing SH-SY5Y cells.A:Western blotting for detecting IRF-1 protein levels in WT α-Syn or A53T α-Syn overexpressing SH-SY5Y cells treated with 0.2 μmol/L MG132 or 30 μmol/L chloroquine.B:Quantitative analysis of IRF-1 expression relative to β-actin.*P＜0.05,***P＜0.001 vs control;##P＜0.01 vs WT α-Syn group;^^P＜0.01 vsA53T α-Syn group.n=6.

2.5 α-Syn过表达导致MDM2蛋白水平降低

WT α-Syn和A53T α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞中，MDM2的蛋白水平显著降低，与空载组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01，图5A，B）。同样地，3月龄和6月龄小鼠黑质区MDM2 的蛋白水平也出现降低，与同窝野生型小鼠相比，差异具有统计学意义（P＜0.001，图5C，D）。

图5 α-Syn过表达对MDM2蛋白表达的影响Fig.5 Effects of α-Syn overexpression on MDM2 protein levels.Western blot was used to detect MDM2 protein levels in WT α-Syn or A53T α-Syn overexpressed SH-SY5Y cells(A,B)and in the SN of 3 and 6-month A53T α-Syn transgenic mice(C,D).Data were presented as the ratio of IRF-1 to β-tubulin.**P＜0.01,***P＜0.001 vs control;##P＜0.01 vs WT α-Syn group;^^^P＜0.001 vs WT group.n=6.

2.6 α-Syn抑制IRF-1的泛素化修饰

应用泛素化实验检测α-Syn过表达对IRF-1泛素化水平的影响。结果显示，与空载组相比（第2泳道，图6），过表达WT α-Syn和A53T α-Syn后，IRF-1的泛素化水平明显降低（第3和第4泳道，图6）。

图6 α-Syn过表达对IRF-1泛素化水平的影响Fig.6 Ubiquitylation assay for determining IRF-1 ubiquitylation levels in WT α-Syn or A53T α-Syn overexpressing SH-SY5Y cells treated with 20 μmol/L MG132 for 8 h.Panels are representative results of 3 independent experiments.

3 讨论

PD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其病因和发病机制十分复杂，免疫系统紊乱和炎症反应被证实参与了PD的神经退变过程［20］。Sulzer等研究发现，PD可能是一种自身免疫性疾病［15］。PD患者以及动物模型的脑组织、脑脊液和血清中均检测到较高的炎性因子表达，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）、IL-1β等［21,22］。大量研究证实，炎症反应诱导的多巴胺能神经元变性死亡是导致PD发生的一个关键因素［23］。目前靶向神经免疫炎症成为PD治疗的潜在靶点，应用非甾体类抗炎药（NSAIDs）可显著降低PD 的发病风险［20,21］，但由于长期服用会产生严重的副作用，如胃肠道反应，肾脏和其它器官系统的损害等，限制了其在临床的应用［24］。因此，深入了解神经炎症在PD发病机制中的作用，合理调控脑内的炎性反应，为开发新型的PD治疗药物提供新的思路。

α-Syn作为PD的特征性病理标志路易小体的主要成分，是第一个被确定与PD发病相关的突变蛋白，其基因错义突变（A53T,A30P,E46Κ等）可导致家族遗传性PD的发生［25,26］。在正常生理条件下，α-Syn不具有神经毒性，主要富集于突触前末梢，但是在某些病理状态下，细胞内α-Syn单体发生错误折叠和异常聚集，形成寡聚体和纤维状多聚体，具有细胞毒性。α-Syn异常聚集不仅导致线粒体功能障碍，加重细胞的氧化应激损伤，还可诱发神经元内炎症反应的发生，促炎因子释放增多，导致多巴胺能神经元炎性损伤［27-29］。但是，PD中α-Syn诱发炎症反应，最终导致神经退变的分子机制尚未阐明。深入探讨α-Syn触发免疫炎症反应的分子机制，对于了解α-Syn在PD神经退行性病变中的作用，具有重要的科学意义和应用价值。

IRF-1是IRF家族中最早被发现的，由329个氨基酸组成的多功能转录因子，通过诱导IFN 基因表达，参与免疫应答、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物学功能［30,31］。正常生理状态下，IRF-1位于胞浆中，处于失活或较低水平表达状态，当细胞受到干扰素γ（IFN-γ）、TNF-α、IL-6等因素刺激后，IRF-1发生磷酸化和二聚化，入核后通过与IRF-E结合，激活IFN基因转录，发挥免疫调节功能［32］。IRF-1既能被IFN-γ诱导生成，同时也能介导IFN-γ刺激的NO合成基因的表达［33］。IRF-1基因敲除小鼠的淋巴细胞中缺乏成熟的CD8+T细胞、巨噬细胞IL-12 产生缺失以及NΚ 细胞发育缺陷，说明IRF-1对免疫细胞的发育和激活发挥重要作用［34］。虽然IRF-1介导的免疫应答和抗病毒作用已在多种疾病中被广泛报道，但是其在PD中的作用尚未阐明。本实验中我们观察到，不论是α-Syn过表达的SH-SY5Y细胞，还是A53T α-Syn转基因小鼠黑质区，IRF-1的蛋白水平均上调，并且α-Syn过表达促进IRF-1从胞浆转移到胞核中，可能激活下游免疫相关基因的转录，提示IRF-1介导的免疫炎症反应可能是导致PD发病的原因之一。

我们进一步在PD模型中研究了α-Syn调控IRF-1表达的分子机制，结果显示α-Syn过表达不影响IRF-1 mRNA水平，却可显著上调其蛋白表达，提示α-Syn对IRF-1的调控发生在转录后、翻译或翻译后修饰水平。细胞内IRF-1的表达受到严密的调控，其中泛素化修饰和蛋白酶体降解是维持IRF-1 蛋白稳定性的重要途径［35］。泛素-蛋白酶体系统是真核生物细胞内具有高度选择性的蛋白质降解途径，涉及细胞周期调控、凋亡、应激反应、DNA修复、抗原提呈、信号转导、癌症、炎症等诸多生物学过程，主要是由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、蛋白酶体及其底物形成的一种级联反应［36］。一般靶蛋白的泛素化需要特异的E3泛素连接酶来识别和结合靶蛋白序列，经泛素化修饰的靶蛋白然后会进入蛋白酶体被降解［37］。MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，具有细胞通透性，在体内和体外均已被证实可有效抑制蛋白酶体活性［38］。氯喹作为自噬溶酶体的抑制剂，不仅广泛用于治疗疟疾和类风湿性关节炎，还可通过调控肿瘤免疫反应，发挥抗肿瘤的作用［39］。本实验中我们观察到，蛋白酶体抑制剂MG132处理可显著加剧α-Syn对IRF-1蛋白表达的上调作用，而溶酶体抑制剂氯喹不影响IRF-1的蛋白水平，说明α-Syn通过泛素蛋白酶体途径，而非自噬溶酶体途径，调控IRF-1的蛋白表达。

在泛素蛋白酶体途径中，E3泛素连接酶决定靶蛋白的特异性识别，通过调控蛋白的泛素化过程参与细胞内的多种生物学过程，如细胞周期调控、信号转导、DNA修复、蛋白质的质量控制等［40,41］。目前发现鉴定的E3泛素连接酶主要有HECT结构域家族、RING结构域家族、U-box蛋白家族。MDM2作为RING结构域家族的E3泛素连接酶，在结构上包含四个进化保守的结构域：C端的两个环指结构（RING1和RING2）、环指间区（IBR）形成的锌指结构域、N端的泛素样结构域（UBL）以及特异性的酸性序列结构域，从而表现出E3泛素连接酶活性［42,43］。已有研究证实，MDM2参与调控IRF-1的泛素化降解，发挥抗病毒和免疫调节功能。MDM2除了与p53形成负反馈调节机制，参与调控细胞周期、增殖和凋亡以外［44］，最近有研究表明，MDM2可直接激活parkin，促进线粒体自噬的发生，从而发挥神经保护作用［45］。本实验中我们观察到，α-Syn过表达通过抑制MDM2蛋白表达及其介导的IRF-1泛素化修饰，从而上调IRF-1蛋白水平，揭示了异常聚集的α-Syn调控IRF-1蛋白表达的分子机制及其在PD神经免疫炎症反应中的作用。

本研究深入探讨α-Syn通过上调IRF-1表达，进而诱导神经免疫炎症反应的发生。α-Syn对IRF-1的调控并非发生在转录水平，而是通过抑制MDM2对IRF-1的泛素化修饰，导致IRF-1蛋白水平升高。本研究为α-Syn调控IRF-1参与PD神经退变提供新的机制，合理调控中枢神经系统免疫炎症反应，有望保护多巴胺能神经元，从而为PD 临床治疗提供有价值的靶点和理论依据。