粪便中脱落细胞基因检测在炎症性肠病诊断中的临床价值

刘秀卿 顾大勇 李延武 郭海建 李太晗

作者单位：深圳市第二人民医院检验科，广东，深圳518035

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）发病率为1.74/10 万，近年来呈上升趋势［1］，以南方地区多发，是消化道常见慢性非特异性炎症病变。IBD 主要病变在肠道，但也可累及多种器官、系统，故需尽早诊疗，虽然IBD 治愈率低，但通过一系列治疗后，可缓解病情，使得患者能够像正常人群一样工作、生活，为了保证患者后期得到及时、有效救治，还需注重疾病筛查，以便及时为临床治疗提供科学依据［2］。组织病理学检查、内镜检查是评估肠道炎症活动度的金标准，虽诊断准确率高，但反复内镜检查可给患者带来经济负担，且存在出血、穿孔等风险，加重身心负担，故无法首推［3］。粪便DNA 检测具有诊断效能高、方便、无创等优势，其中DNA 甲基化是最早发现的修饰途径之一，与多种疾病的发生、发展密切相关，目前已有学者用于结直肠癌检测中［4］，通过检测粪便中脱落细胞的肿瘤标志物来判断患病风险，其中使用的目标基因为黏结蛋白聚糖2（Syndecan 2，SDC2），内参基因为β 肌动蛋白（β-actin，ACTB），而且在该技术的开发过程中，也观察到一些IBD患者出现了ACTB基因水平异常升高，但当前未有深入研究。本文就此展开深入调查，分析SDC2、ACTB在预测IBD 中效能以及与临床病理特征相关性。

1 资料和方法

1.1 资料

分析在2020年6月至2021年6月深圳市第二人民医院收集的70 例IBD患者（观察组）、30例健康人群（对照组）作为研究对象。观察组男性48 例，女性22 例，平均年龄（47.45±4.53）岁，平均体重（62.35±4.46）kg；对照组男性18 例，女性12 例，平均年龄（47.33±4.49）岁，平均体重（62.49±4.58）kg。两组性别、体重、年龄比较，差异无统计意义（P＞0.05）。符合《赫尔辛基宣言》［5］伦理审查。纳入标准：①符合《炎症性肠病外科治疗国内外共识与指南》［6］中关于IBD 临床诊断标准；②自愿提供粪便样本，接受粪便DNA检测；③没有任何肿瘤病史；④签署知情同意书。排除标准：①合并脊柱严重畸形者；②有切口疝或腹部疝气者；③可疑结肠穿孔者；④因直肠、肛门畸形或高度狭窄结肠镜无法插入者；⑤下消化道严重梗阻，无法排便、排气者。本研究经院伦理委员会批准同意。

1.2 样本收集

收集受检者各项基本信息，包括年龄、性别、姓名、家族史、联系方式、疾病史等。在接受肠镜检查后7～30 天进行粪便样本采集，在采集前嘱咐受检者正常饮食，对于服用黄连素等影响检测结果者，需停药一周。收集粪便样本时，严格按照说明书操作，保证DNA 样本不降解，采样后24 h 内送至检验科。

1.3 检测方式

进行粪便DNA 提取和qPCR 检测。首先将粪便样本震荡混匀，离心10 min，5 000 rpm，取上清，保存于-80℃，待检。检测时，先从冰箱取出样本，待融解后，取3.2 mL 上清过SPE 柱，将杂质去除，加入特异性磁珠捕获目标基因，提取的基因组DNA，取2 μL 用超微量分光光度计Nanodrop one测定仪测定浓度及纯度。开展qPCR 法检测，使用广州康立明生物人类SDC2基因甲基化检测试剂盒（国械注准20183400506）与上海宏石全自动医用分析系统SLAN-96S，采用荧光PCR 法检测ACTB、SDC2。具体步骤如下：取10 μL 粪便样本中提取的DNA，加入1×GoTaq 缓冲液，5 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs，2.5 U GoTaq 热启动聚合酶（Promega），上下游引物各0.5 μM，0.2 μM Taqman 探针，总反应体系30 μL。在PCR 仪上扩增，反应条件：变性95℃5 min，（95℃15 s，58℃30 s，72℃30s）×48 个循环，冷却40℃30 s。各基因临界值：根据ACTBCt 临界值26.86，ACTB的Ct 值＜26.86 为阳性，Ct 值≥26.86 为阴性；SDC2Ct 临界值38.97，SDC2的Ct值＜38.97 为阳性，Ct 值≥38.97 为阴性。阳性率=阳性标本例数/总例数×100%。

1.4 统计学处理

运用SPSS 22.0 统计学软件处理；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；计量资料用（）表示，行t检验，F值采用方差分析；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析ACTB的Ct 值、SDC2甲基化的Ct值及两项联合预测价值；采用Spearman 法分析相关性；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比较

两组SDC2甲基化检测Ct 值、阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），观察组ACTB的阳性率高于对照组，ACTBCt 值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of actb gene level and SDC2 methylation level between the two groups［n（%），（±s）］

表1 两组ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of actb gene level and SDC2 methylation level between the two groups［n（%），（±s）］

组别观察组对照组χ2/t 值P 值n 70 30 ACTB阳性率67（95.71）3（10.00）73.469＜0.001 Ct 值25.78±1.63 32.12±1.13 19.375＜0.001 SDC2阳性率5（7.14）2（6.67）0.007 0.932 Ct 值40.78±1.25 40.79±1.33 0.396 0.693

2.2 ROC 曲线分析

经ROC 曲线分析，内参基因ACTB、SDC2甲基化Ct 值预测炎症性肠病的AUC 分别为0.918、0.473（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 分析各项指标预测预后的AUC 值Table 2 Analysis of the AUC value of various indicators to predict prognosis

图1 ACTB Ct、SDC2 Ct 预测的ROC 曲线图Figure 1 ACTB Ct，SDC2 Ct predicted ROC curve

2.3 观察组不同临床病理特征的ACTB 基因水平的比较

不同性别、年龄段患者内参基因ACTB的Ct值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不同病程、病变位置患者内参基因ACTB的Ct 值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 观察组不同临床病理特征的ACTB 基因水平的比较Table 3 Comparison of ACTB gene levels with different clinicopathological characteristics in observation group

2.4 相关性分析

经Spearman 法分析，内参基因ACTB水平与年龄、性别不存在相关性（P＞0.05），与病程、病变位置呈正相关性（P＜0.05）。见表4。

表4 内参基因ACTB水平与临床病理特征的相关性分析Table 4 Correlation between ACTB level of internal reference gene and clinicopathological features

3 讨论

诊断IBD 金标准为肠镜联合组织学病理检查，虽准确率较高，但属于创伤性操作，且存在出血、穿孔等风险，患者依从率较低［7］。粪便潜血实验是早期临床推荐的非侵入手段，虽具有无创、简便优势，但特异性、敏感性低，尤其是对于微小病变者，误诊率较高。因此，基于粪便、血液等生物样本的精准无创检测便成为肠道炎症病变新选择。有研究表明［8］，病变患者粪便中脱落细胞在碱性环境下，可减慢降解速度，因此学者提议将粪便中脱落细胞DNA 基因作为检测标本。随着分子生物学发展，分子生物学标记已逐渐成为肠道病变新型无创检测技术，通过测序技术分析DNA 基因突变，具有更好的特异性和敏感性，但测序技术成本较高，步骤复杂，不利于推广于IBD 中。相比之下，实时荧光定量PCR 检测更值得推广，具有成本低廉、步骤简便优势，且作为非侵入性操作，更易被人们接受。

DNA 甲基化是肠道癌症病变发生、发展中一个早期重要事件，故异常DNA 甲基化可作为早期诊断、预测病变的分子标记物［9］。SDC2基因甲基化是肿瘤早期筛查分子标记物；SDC2是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中成员之一，属于I 型细胞表面跨膜蛋白聚糖，目前常作为肿瘤标志物，能够调节机体内基因转录，与多种癌症发生、发展密切相关［10］。ACTB是actin 家族中一员，在细胞生理活动方面发挥着重要作用［11］。本研究结果显示，观察组ACTB基因水平阳性率高于对照组，ACTBCt 值低于对照组，说明IBD 病变存在明显脱落细胞异常增多。主要是IBD 病变发展阶段，NO 大量生成，会破环小肠上皮细胞肌动蛋白，导致肌动蛋白丝网络解体，从而引起上皮细胞功能失调，而ACTB基因参与了细胞迁移和分裂，在IBD 充质细胞中存在异常表达，故引起内参基因ACTB表达异常升高［12-13］。经ROC 曲线分析，内参基因ACTB、SDC2甲基化Ct 值预测炎症性肠病的AUC 分别为0.918、0.473，说明内参基因ACTB检测效能较高，能有效避免盲目大规模肠镜筛查带来的弊端和创伤性，同时节约了医疗资源，提高检测阳性率［14］。而SDC2基因甲基化在肠炎中无特异性表现，敏感性和特异性较低，曹亚萍［15］学者发现SDC2基因在肠癌患者以及癌前病变中表现为异常的高度甲基化，在其他良性疾病（包括肠炎）中则没有表现为高度甲基化。此外，经Spearman 法分析，ACTB与年龄、性别不存在相关性，与病程呈正相关性，说明ACTB可受到疾病严重程度影响。而与病变位置也存在正相关性的原因可能是基因组DNA 来源不同，且本研究纳入例数也较少，可对结果造成一定影响，故关于病变位置与脱落细胞ACTB基因的相关性还有待进一步探索。

综上所述，粪便中脱落细胞基因检测是一项灵敏性高、无创、简便、检测迅速的筛查技术，内参基因ACTB用于IBD 筛查中，可提高诊断效能，对疾病发生、发展起到一定预测评估作用，而SDC2甲基化与肠炎无直接关系。但本次研究样本量较小，可造成分类偏差大，并未进行长期随访，故关于脱落细胞ACTB基因检测效能还需进一步探索。