抗金银花白粉病菌贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株培养基及发酵条件优化

黎燕珊 崔文艳 张陈芳 黄小欣 何朋杰

摘要：【目的】优化抗金银花白粉病菌贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株的发酵培养基及发酵条件，为其快速大量生产及进行大田生物防治提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株为材料，采用单因素试验和正交试验，分别优化其发酵培养基及发酵条件;结合分生孢子萌发和平板对峙试验，分析优化方案下HC-8菌株对白粉病菌分生孢子萌发的抑制效果及对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的拮抗活性。【结果】HC-8菌株最适基础培养基为酵母蛋白胨培养基（YSP）;最佳培养基配方为蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L、麦芽糖10.0 g/L;最佳发酵条件为温度37 ℃、初始pH 6.0、转速180 r/min、接种量0.100%、装液量20 mL/300 mL、培养时间48 h。优化方案下，HC-8菌株对白粉病菌分生孢子萌发的抑制率为83.15%，显著高于优化前的74.65%（P<0.05，下同）;對尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的抑菌率分别为60.66%、59.03%和65.32%，显著高于优化前的54.31%、55.24%和59.17%。【结论】优化后的方案可提高HC-8菌株的发酵产量，并增强对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的拮抗效果及对白粉病菌分生孢子萌发的抑制效果。建立的方案可用于快速、大批量发酵HC-8菌悬液。

关键词： 金银花;白粉病菌;贝莱斯芽孢杆菌;发酵条件;正交试验;拮抗活性

中图分类号： S435.67;S481.19                     文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2148-10

Optimization of culture medium and fermentation parameters of Bacillus velezensis HC-8 antagonistic to Erysiphe lonicerae

LI Yan-shan， CUI Wen-yan， ZHANG Chen-fang， HUANG Xiao-xin， HE Peng-jie*

（Institute of Traditional Chinese Medicine Cultivating（Breeding） and Processing Technology， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】To provide a theoretical basis for rapid mass production and executing field biocontrol of Bacillus velezensis HC-8 strain antagonistic to Erysiphe lonicerae， it is necessary to optimize its fermentation media and conditions. 【Method】In this study， the strain HC-8 was used as the material， and the single factor experiment and orthogonal test were employed to optimize the fermentation media and conditions; combined with conidial germination assays and plate confrontation test to analyze the inhibition effect of strain HC-8 on conidial germination of E. lonicerae and antifungal activity of strain HC-8 against Fusarium oxysporum， Phytophthora nicotianae and F. verticillioides under the optimized fermentation conditions. 【Result】The most suitable media for HC-8 strain was yeast saccharose peptone media （YSP）; the best media formula was peptone concentration of 5.0 g/L， yeast extract concentration of 25.0 g/L and maltose concentration of 10.0 g/L; and the most suitable culture conditions were the fermentation temperature of 37 ℃， the initial pH of 6.0， the shaking speed of 180 r/min， the inoculation volume of 0.100%（v/v）， the liquid medium volume of 20 mL/ 300 mL and the incubation time of 48 h. Moreover， strain HC-8 showed inhibition rates of 83.15% on E. lonicerae conidial germination under the optimized fermentation conditions， significantly higher than of 74.65% before optimization（P<0.05， the same below）. Furthermore， strain HC-8 displayed inhibition rates of 60.66%， 59.03% and 65.32% against F. oxysporum， P. nicotianae and F. verticillioides， respectively， under the optimized fermentation conditions， which were significantly higher than of 54.31%， 55.24% and 59.17% ， respectively， under the condition of before optimization. 【Conclusion】The optimized medium and fermentation conditions can effectively increase the fermentation yield and antagonistic activity of strain HC-8 against F. oxysporum， P. nicotianae and F. verticillioides， as well as the inhibition on E. lonicerae conidial germination. The optimized scheme can be used in rapid and mass production of fermented HC-8 bacterial suspension.

Key words： Lonicera japonica Thunb.; Erysiphe lonicerae; Bacillus velezensis; fermentation conditions; orthogonal test; antagonistic activity

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Project （QKHZC〔2020〕4Y099）; Guizhou Science and Technology Project（QKHJC-ZK〔2021〕146）; College Students Innovation and Entrepreneurship Training Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine（GZYDCHZ〔2020〕47）

0 引言

【研究意义】金银花（Lonicera japonica Thunb.）别名二花、忍冬、鸳鸯花，是忍冬科忍冬属植物，既可药用，又可代茶常饮，具有抗炎解热（王亚琼等，2016）、抗菌（张忠斌等，2019）和保护肝脏（Miao et al.，2019）等作用，在新型冠状病毒的预防和治疗中也发挥积极作用（胡芬等，2021）。由忍冬叉丝壳菌（Microsphaera lonicerae）引起的白粉病是金银花种植过程中的主要病害之一（吴家庆等，2014）。陈永超（2014）于2010—2013年对贵州省绥阳县金银花种植示范区内的白粉病发病情况开展调查后发现，叶片发病率为7.2%～41.7%，最高达66.4%～85.2%，花蕾发病率为4.2%～44.3%，最高达100.0%，证实白粉病已成为绥阳县金银花产业发展的障碍，对金银花种植户造成了极大的经济损失。本课题组前期研究发现，从白粉病重病田的健康金银花叶片内分离获得的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HC-8菌株对金银花白粉病具有良好的生防效果，且对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌等病原真菌具有显著的抑制作用。生防菌能否转化为产品并走进实际应用常受到多种因素影响，而发酵是一个重要的影响环节。在微生物发酵过程中，培养基配方和发酵条件对其生长速度、菌体量及抑菌活性等均具有显著影响。此外，相同种、属的不同菌株的最适发酵条件由于其遗传背景、生理特性及对生境条件的偏好性不同而存在较大差异（吴志美等，2019）。因此，明确HC-8菌株的最佳培养基及发酵条件对实现贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株的快速大量生产及后续应用于金银花白粉病大田生物防治均具有重要意义。【前人研究进展】目前，生产上金银花白粉病的防治以化学防治为主，化学药剂防治虽能起到一定的作用（夏永刚等，2012;杨帆，2017），但过量使用会引起严重的农药残留等问题（He et al.，2019），因此亟需寻找新的安全环保的防治途径。利用选择性强、绿色、无公害的生防微生物及其代谢物进行生物防治，被认为是一种环境友好型的选择（Li et al.，2015）。Khalaf和Raizada（2018）自南瓜种子内分离得到169株内生细菌，能拮抗包括白粉病菌在内的多种常见植物病原真菌和卵菌。芽孢杆菌是一类广泛分布于土壤、水体和动植物体内的革兰氏阳性细菌，由于其能高效防控白粉病等植物病害，且对人畜、环境安全无害，已被广泛应用于农业和食品加工等领域（Cui et al.，2019;He et al.，2021）。Tanaka等（2017）研究证实贝莱斯芽孢杆菌SD-32能有效防控小麦白粉病与其诱导植物系统抗性相关。Jiao等（2020）从烟草组织内筛选获得1株贝莱斯芽孢杆菌（解淀粉芽孢杆菌植物亚种）YN201732，进一步研究发现YN201732菌株能高效防控烟草白粉病。近年来，有关芽孢杆菌发酵条件优化的报道较多，但不同菌株的最佳发酵条件存在较大差异。以芽孢杆菌的最佳培养温度和发酵时间为例，王玲等（2014）研究发现解淀粉芽孢杆菌L009菌株发酵的最佳条件为温度28 ℃、培养时间72 h;汪晶晶等（2018）报道解淀粉芽孢杆菌GM-1-2菌株的最佳发酵条件为温度28 ℃、培养时间30 h;杨可等（2019）发现贝莱斯芽孢杆菌TCS001菌株的最适培养温度和时间分别为25 ℃和36 h。目前，国内外关于金银花病害的研究报道较少，尤其是金银花白粉病无公害防治方面的研究更少，尚未发现适宜应用的生产型拮抗菌株，更缺乏详细的发酵条件研究。【本研究切入点】本课题组前期从金银花叶片组织中分离得到102株内生细菌，且发现贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株对白粉病有良好的防治效果，但目前仅初步进行了温室盆栽防效验证，尚缺乏详细的发酵条件研究。【拟解决的关键问题】采用单因素试验及正交试验方法对HC-8菌株的基础发酵培养基和发酵条件（温度、初始pH、接种量、发酵时间、装液量、转速）进行优化，明确其最佳发酵条件;测定优化培养基和发酵条件后HC-8菌株对尖孢镰刀菌、烟草疫霉及轮状镰刀菌的拮抗活性，为利用生防细菌对金银花白粉病开展生物防治研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

1. 1. 1 供试菌株 贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株为本课题组前期自金银花植株叶片组织中分离保存。病原真菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和轮状镰刀菌（F. verticillioides）由贵州中医药大学中药材病害防控实验室保存;供试白粉病菌菌株忍冬叉丝壳菌（M. lonicerae）從本课题组试验温室内感染白粉病的金银花植株叶片上分离获得。

1. 1. 2 供试培养基 LB液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠6.0 g/L，pH 7.2;马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖14.0 g/L，加水至1000 mL，pH 7.2～7.4;基本培养基：KH2PO4 22.00 mmol/L，Na2HPO4·12H2O 33.70 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.00 mmol/L，NaC1 8.55 mmol/L，CaCl2·H2O 0.30 mmol/L，EDTA 0.17 mmol/L，FeCl3 0.03 mmol/L，CoCl2 0.420 ?mol/L，CuC12 0.760 ?mol/L，ZnCl2 6.200 ?mol/L，H3BO3 1.620 ?mol/L，MnCl2·4H2O 0.080 ?mol/L，biotin 0.004 ?mol/L，thaiamin-HCl 0.003 ?mol/L，NH4C1 8.93 mmol/L，碳源2.0 g/L，pH 7.0;营养培养基（NB）：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L;细菌基本培养基（CM）：葡萄糖5.0 g/L，（NH4）2SO4 2.0 g/L，柠檬酸钠1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO4 4.0 g/L，KH2PO4 6.0 g/L;NYBD培养基：牛肉浸膏8.0 g/L，酵母浸膏5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L;酵母蛋白胨培养基（YSP）：蛋白胨2.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，蔗糖4.0 g/L。固体培养基的配制方法为在液体培养基配方的基础上加入琼脂粉15～18 g。

1. 2 HC-8菌株种子液的制备

从-80 ℃冰箱内取出HC-8甘油菌，在LB固体培养基上划线活化，37 ℃过夜培养后，挑取单菌落接种至含有50 mL LB液体培养基的300 mL三角瓶内，于37 ℃下160 r/min振荡培养至对数期（OD600 =0.8）。

1. 3 培养基种类对HC-8菌株生长速度的影响

分别向含有100 mL YSP、NYBD、NB、CM和LB培养基的300 mL三角瓶中接入1 mL的HC-8菌株种子液，以不接种菌株为空白对照，于37 ℃下160 r/min振荡培养，24 h后用紫外分光光度计测定600 nm波长处的吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，比较HC-8菌株在不同培养基中的生长速度差异。

1. 4 培养基组分优化

1. 4. 1 不同碳源对HC-8菌株生长速度的影响 向基本培养基中分别加入2.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇等6种不同碳源作为唯一碳源，然后分别向含有100 mL上述6种液体培养基的300 mL三角瓶内接入1 mL HC-8菌株种子液，于37 ℃下160 r/min振荡培养24 h，每种培养基设3个重复。培养结束后立即取样，测定不同碳源条件下菌液在600 nm波长处的吸光度，比较HC-8菌株在不同碳源的基础发酵培养基中的生长速度差异。

1. 4. 2 不同氮源对HC-8菌株生长速度的影响 向基本培养基中分别加入1.4 g/L甘氨酸、蛋白胨、氯化铵、胰蛋白胨、谷氨酸和酵母膏等6种不同氮源替代原有的氯化铵作为唯一氮源，加入2.0 g/L的1.4.1中筛选出的最适碳源，于37 ℃下160 r/min振荡培养24 h，每种培养基设3个重复。培养结束后立即取样，测定不同氮源条件下菌液在600 nm波长处的吸光度，比较HC-8菌株在不同氮源的基础发酵培养基中的生长速度差异。

1. 4. 3 碳、氮源最佳浓度单因素试验 以1.3中筛选出的最适培养基为基础培养基，分别加入2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L的1.4.1中筛选出的最适碳源取代原有碳源;分别加入1.0、3.0、5.0、7.0、9.0和11.0 g/L的1.4.2中筛选出的最佳氮源取代原有氮源，于37 ℃下160 r/min振荡培养24 h，每种培养基设3个重复。培养结束后立即取样，测定不同条件下菌液在600 nm波长处的吸光度，比较HC-8菌株在含不同浓度碳、氮源基础培养基中的生长速度差异。

1. 4. 4 碳、氮源正交试验 设计正交试验，将从1.3～1.4.3中筛选出的适宜HC-8菌株生长的最优培养基组分进行正交试验，进一步确定最优培养基组合。

1. 5 发酵条件优化

1. 5. 1 温度、初始pH及发酵时间单因素试验 采用单因素试验研究温度、初始pH及发酵时间对HC-8菌株生长速度的影响。温度、初始pH及发酵时间均设7个水平，温度设22、25、28、31、34、37和40 ℃，初始pH设4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，发酵时间设0、12、24、36、48、60和72 h，每处理3个重复。培养结束后立即取样，测定不同条件下菌液在600 nm波长处的吸光度，比较不同温度、初始pH及发酵时间对HC-8菌株生长速度的影响。

1. 5. 2 温度、初始pH及发酵时间正交试验 设计L9（33）正交表，设3因素3水平正交试验对1.5.1中筛选出的适宜HC-8菌株生长的温度、初始pH及发酵时间进行正交试验，筛选HC-8菌株的最佳发酵时间、温度和pH。

1. 5. 3 接种量、装液量和转速单因素试验 采用单因素试验，研究接种量、装液量和转速对HC-8菌株生长速度的影响。接种量设7个水平（0.050%、0.100%、0.500%、1.000%、1.500%、2.000%和2.500%），装液量设6个水平（20、40、80、120、160和200 mL），转速设6个水平（140、160、180、200、220和240 r/min），每处理3个重复。于37 ℃下180 r/min振荡培养48 h后立即取样，测定不同条件下菌液在600 nm波长处的吸光度，比较不同接种量、装液量和转速对HC-8菌株生长速度的影响。

1. 5. 4 接种量、装液量和转速正交试验 设计L9（33）正交表，设3因素3水平正交试验对1.5.3中筛选出的适宜HC-8菌株生长的接菌量、装液量及转速进行正交试验，筛选HC-8菌株的最佳接种量、装液量和转速。

1. 6 室内抗生试验

HC-8菌株无菌发酵液制备：以1%比例将HC-8菌株种子液转接至含有50 mL液体LB培养基的300 mL三角瓶内，37 ℃下160 r/min振荡培养48 h;或以0.1%比例将HC-8菌株种子液转接至本研究优化后的培养基中于优化后的发酵条件下振荡培养48 h。培养结束后，用无菌离心管收集发酵液;于室温下12000×g离心15 min，收集上清液;用细菌过滤器（0.22 μm）对上清液进行过滤，即制得无菌发酵液，现配现用。

白粉病菌分生孢子悬浮液制备：采集自然发病7～10 d的金银花叶片置于含有12 mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中轻柔洗涤，用于收集叶片表面的白粉病菌分生孢子，然后置于5000 r/min下室温离心5 min，弃水相收集分生孢子，借助光学显微镜用无菌PBS缓冲液（pH 7.0）重悬分生孢子至5×104个/mL，现配现用。

采用琼脂扩散法（Cui et al.，2019）测定HC-8菌株无菌发酵液對常见植物病原真菌的拮抗活性。先用无菌打孔器（d=8 mm）在已活化好的供试病原真菌上打孔，用无菌接种针将菌块转移至新的PDA培养基中央，采用十字交叉法在相距病原真菌菌块3 cm处等距离摆放4个牛津杯（d=6 mm），于28 ℃下培养24 h后向每个牛津杯加入200 μL HC-8菌株无菌发酵液，28 ℃继续培养4 d后用游标卡尺分别测量病原真菌的直径，计算HC-8菌株对不同病原真菌的拮抗效果。每处理3次重复。

抑菌率（%）=（1-处理组真菌直径/对照组真菌

直径）×100

采用水琼脂法（Jiao et al.，2020）测定HC-8菌株无菌发酵液对白粉病菌分生孢子萌发的抑制活性。先配制3%水琼脂培养基，高温灭菌;倒平板前按1∶9的比例加入HC-8菌株无菌发酵液;倒板后用喉头喷雾器将孢子悬浮液（5×104个/mL）均匀喷洒在培养基上。以接种PBS缓冲液为空白对照。每处理5次重复。25 ℃避光培养24 h，于光学显微镜下观察孢子的萌发情况，每处理观察60个视野，每个视野观察5个分生孢子，分别计算视野内孢子萌发率和孢子萌发抑制率。

萌发率（%）=萌发孢子数/总孢子数×100

萌发抑制率（%）=（1-处理组孢子萌发率/对照

组孢子萌发率）×100

1. 7 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，运用SPSS 26.0进行独立t检验或单因素方差分析，采用Duncans新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 培养基种类对HC-8菌株生长速度的影响

由图1可知，HC-8菌株在YSP、NYBD、LB、NB和CM等5种不同培养基中的生长速度存在显著差异，其中在YSP培养基中的菌体浓度最大，OD600为2.03，显著高于其他培养基处理（P<0.05，下同），因此选择YSP培养基作为后续培养基组分优化试验的基础培养基。

2. 2 培养基优化结果

2. 2. 1 碳源对HC-8菌株生长速度的影响 由图2可知，HC-8菌株分别在以麦芽糖、淀粉、蔗糖、甘露醇、乳糖和葡萄糖为唯一碳源的培养基上的生长速度存在显著差异，其中以麦芽糖为碳源时菌株的浓度最大，OD600为1.59，因此选择麦芽糖为后续单因素试验和正交试验的碳源。

2. 2. 2 氮源对HC-8菌株生长速度的影响 由图3可知，HC-8菌株在以甘氨酸、谷氨酸、氯化铵、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母膏为唯一氮源的培养基上的生长速度存在显著差异，其中以酵母膏处理的菌株生长最快，浓度最大，OD600为1.73，其次为蛋白胨处理，OD600为1.55，考虑到酵母膏的成分较复杂，因此同时选择酵母膏和蛋白胨为后续单因素试验和正交试验的氮源。

2. 2. 3 碳源和氮源单因素试验结果 为评估碳源和氮源等培养基组分对HC-8菌株生长速度的影响，分别以不同浓度的麦芽糖、蛋白胨和酵母膏代替YSP培养基原有相应组分。由图4可知，随着麦芽糖、蛋白胨和酵母膏浓度的升高，发酵液中菌体浓度呈先升高后降低的趋势，其中，麦芽糖、蛋白胨和酵母膏的最佳添加量分别为7.5、7.0和25.0 g/L。因此，后续3因素3水平的正交试验中麦芽糖采用5.0、7.5和10.0 g/L、蛋白胨采用5.0、7.0和9.0 g/L、酵母膏采用15.0、20.0和25.0 g/L较合理。

2. 2. 4 碳源与氮源正交试验结果 碳源与氮源正交试验结果（表1）显示RC>RB>RA，表明碳源麦芽糖含量变化对HC-8菌株生长速度影响最大，其余依次为酵母膏和蛋白胨，最佳组合为A1B3C3，即最佳培养基组分为蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麦芽糖10.0 g/L。

2. 3 HC-8菌株发酵条件优化结果

2. 3. 1 培养温度 HC-8菌株在不同培养温度条件下生长速度存在显著差异（图5-A），随着发酵温度的升高，发酵液中菌体浓度呈先逐渐升高后下降的趋势，37 ℃时HC-8菌株生长最快，OD600为2.56，且在31～37 ℃内生长较好，因此正交试验选择34、37和40 ℃ 3个水平较合理。

2. 3. 2 初始pH HC-8菌株在不同pH培养条件下生长速度存在显著差异（图5-B），随着初始pH的升高，发酵液中菌体浓度呈先升高后降低的趋势，其中，pH为4.0时菌株几乎不能生长，OD600接近0;pH为5.0时HC-8菌株生长最快，OD600最大，为2.32;pH在5.0～7.0时HC-8菌株均生长较好，因此，正交试验选择pH为5.0、6.0和7.0 3个水平较合理。

2. 3. 3 培养时间 HC-8菌株在不同培养时间条件下生长速度存在显著差异（图5-C），发酵液中菌体浓度随着培养时间的增加逐渐上升，在培养时间为0～12 h时菌体数量快速增长，12 h时OD600为1.93;培养12 h后菌体数量增长速度放缓并逐渐趋于稳定，其中培养72 h时菌体浓度最大，OD600为2.19，因此正交试验选择培养时间为48、72和96 h 3个水平较合理。

2. 3. 4 培养时间、温度和初始pH正交试验 培养时间、温度和初始pH正交试验结果（表2）显示RB>RC>RA，说明温度的变化对HC-8菌株生长速度影响最大，其余依次为初始pH和培养时间，其最佳组合为A1B2C2或A2B2C2，即HC-8菌株最佳培养时间为48 h或72 h、最佳温度为37 ℃、最佳初始pH为6.0。考虑到时间成本，在后续试验中选择48 h作为HC-8菌株的发酵时间。

2. 3. 5 接种量 由图5-D可看出，随着接种量的增加，发酵液中HC-8菌株菌体浓度呈逐渐下降趋势，但变化不大，当接种量为0.050%时OD600最大，为2.29，因此后续正交试验选择0.025%、0.050%和0.100% 3个水平较合理。

2. 3. 6 装液量 由图5-E可看出，HC-8菌株的生长速度随着装液量的增加而逐渐降低，但变化不大，在300 mL的三角瓶中，当初始裝液量为20 mL时OD600最大，为2.22，因此后续正交试验选择10、20和40 mL 3个水平较合理。

2. 3. 7 转速 由图5-F可知，随着转速的增加，发酵液中菌体浓度呈先升高后降低的趋势，当转速为180 r/min时OD600达最大值，为2.74，当转速高于或低于180 r/min时发酵液中菌体浓度均有所下降，因此后续正交试验选择160、180和200 r/min 3个水平较合理。

2. 3. 8 接种量、装液量和转速正交试验结果 接种量、装液量和转速正交试验结果（表3）显示RB>RA>RC，说明装液量对HC-8菌株生长速度的影响最大，其余依次为接种量和转速，其最佳组合为A3B2C2，即最佳发酵条件为接种量0.100%、装液量20 mL/300 mL、转速180 r/min。

2. 4 平板拮抗验证结果

培养基组分优化后的组合为：蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麦芽糖10.0 g/L，发酵条件优化后的组合为：接种量0.100%、装液量20 mL/300 mL、初始pH 6.0、温度37 ℃、培养时间48 h、转速180 r/min。由表4可知，优化后HC-8菌株对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的抑菌率分别为60.66%、59.03%和65.32%，显著高于优化前的54.31%、55.24%和59.17%。

2. 5 白粉病菌分生孢子萌发试验结果

处理24 h后调查分生孢子的萌发情况，结果（表5）显示，对照处理金银花白粉病菌分生孢子萌发率为53.78%，经优化后的HC-8菌株发酵液处理后白粉病菌分生孢子的萌发率为9.06%，明显低于优化前的13.63%;同时，优化后HC-8菌株发酵液对白粉病菌分生孢子的萌发抑制率为83.15%，显著高于优化前的74.65%。

3 讨论

当前，在LB培养基中生长的细菌类型相对单一，室内条件下主要采用LB培养基来培养芽孢杆菌（吴海波等，2018）。本研究分别采用YSP、NYBD、LB、NB和CM培养基对贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株进行摇瓶研究，结果显示，HC-8菌株最适培养基为YSP培养基，其次为LB培养基，与吴志美等（2019）研究发现成团泛菌ZLSY20菌株的最佳培养基为YSP相似。

在微生物生长和发酵过程中，影响因子主要包括碳源、氮源、培养时间、温度、初始pH等，但不同微生物对上述影响因子的选择存在一定差异（邹立飞等，2018;张颖等，2021）。本研究结果表明，HC-8菌株最适培养基组分为蛋白胨5.0 g/L、麦芽糖10.0 g/L和酵母膏25.0 g/L。其中，HC-8菌株的最佳碳源是麦芽糖，虽然不同碳源对HC-8菌株生长速度的影响差异显著，但所有碳源均能被HC-8菌株以较高效率利用，说明HC-8菌株对碳源的选择范围较广。相比之下，HC-8菌株对氮源的利用较偏好酵母膏、蛋白胨和胰蛋白胨，而对其他铵盐的利用率不高，且铵态氮作为氮源时反而抑制HC-8菌株的正常生长。在发酵条件优化方面，通过3水平3因素正交试验分别对初始pH、培养温度、培养时间、装液量、接种量和转速进行优化，发现HC-8菌株在pH为5.0～7.0时长势较好，其最适pH为6.0，与Ye等（2017）的研究结果相近，表明该菌适合在偏弱酸性或中性环境下生长。HC-8菌株在22～40 ℃范围内均能生长，表明HC-8菌株对温度的适应性较强，且于37 ℃下长势最佳，而在低于31 ℃时生长较慢，表明低温不适合该菌的发酵培养，与符可芯等（2020）对芽孢杆菌HNU1菌株的研究结果相似。培养时间对HC-8菌株生长速度影响不大，发酵12 h后即进入稳定生长期，且于培养48 h后菌液浓度最大。装液量与发酵液的溶氧量有关，本研究正交试验结果表明，装液量对该菌株的生长影响较大，当装液量为20 mL/300 mL时HC-8菌株生长最佳。转速和接种量也对HC-8菌株生长速度影响显著，当转速为180 r/min、接种量为0.100%时HC-8菌株生长情况最佳。

相同種、属的不同菌株最适发酵条件也可能存在较大差异，可能与不同菌株的遗传特性、生理特性及其偏好的特定生境有关（吴志美等，2019）。王玲等（2014）研究发现解淀粉芽孢杆菌L009菌株发酵的最优条件为温度28 ℃、转速180 r/min、pH 7.0、培养时间72 h。汪晶晶等（2018）研究报道解淀粉芽孢杆菌GM-1-2菌株发酵的最佳培养基配方为葡萄糖17.5 g/L、酵母膏12.5 g/L、硫酸亚铁0.12 g/L，最佳发酵条件为pH 7.0、温度28 ℃、转速180 r/min、pH 7.0、培养时间30 h、装液量60 mL/250 mL、接种量10%。

长期以来，贝莱斯芽孢杆菌（解淀粉芽孢杆菌植物亚种）作为高效、安全的生防菌株备受人们的关注，其对多种病原菌有抑制作用（Cui et al.，2019;He et al.，2021）。侯宝宏等（2017）对从苹果园土壤中分离出的解淀粉芽孢杆菌TS-1203研究发现，该菌对供试10植物病原菌均具有抑制作用;杨冬静等（2018）从江苏省徐州市铜山区班井村甘薯种植地分离筛选的贝莱斯芽孢杆菌菌株XZ-1对多种常见植物病原菌均具有抑制作用;陈照等（2019）从槟榔树根际土壤中分离得到1株贝莱斯芽孢杆菌HAB-9菌株，研究发现其对17种常见病原真菌有较强的抑制作用。本研究发现贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株无菌发酵液对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌等3种病原真菌的抑制率均超过50.00%，经培养基组分和发酵条件优化后，对该3种病原菌的抑制效果均显著提高。此外，HC-8是本实验室从金银花白粉病重病田的健康植株叶际分离得到的一株生防菌株，因其对白粉病优异的生防效果，现已初步在贵州省金银花种植区试点示范应用，并取得了明显效果。故本研究结果不仅提高了发酵液中HC-8菌株菌体浓度，降低了后续产业化的开发成本，还增强了HC-8菌株发酵液对病原真菌的拮抗作用和生防潜力，为该菌株投入大规模生产提供实验依据。根据本研究结果，在后续的工作中将继续对该菌株在金银花植株体内的定殖情况、抑菌与生防机制及生物制剂的开发等做进一步研究，从而为HC-8菌株的田间应用提供理论依据。

4 结论

贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株的最适培养基及组分为YSP培养基（蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麦芽糖10.0 g/L），最适合HC-8菌株生长的发酵条件为接种量0.100%、装液量20 mL/300 mL、初始pH 6.0、温度37 ℃、培养时间48 h、转速180 r/min。优化后的方案可提高HC-8菌株的发酵产量，并增强对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的拮抗效果及对白粉病菌分生孢子萌发的抑制效果。建立的方案可用于快速、大批量发酵HC-8菌悬液。

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（責任编辑 麻小燕）

收稿日期：2021-08-02

基金项目：贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑〔2020〕4Y099号）;贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK〔2021〕一般146）;贵州中医药大学大学生创新创业训练计划项目（贵中医大创合字〔2020〕47号）

通讯作者：何朋杰（1988-），https：//orcid.org/0000-0003-4379-9126，博士，主要从事植物病害生物防治研究工作，E-mail：gzhepj 2006@163.com

第一作者：黎燕珊（1998-），https：//orcid.org/0000-0002-0736-1576，研究方向为植物病害生物防治，E-mail： 1030042866@qq.com