浙江省衢州地区鼠类携带莱姆病螺旋体研究

张建民，占炳东，陈旭富，曹国平，王双青，吕 磊，杨瑞军，叶承华

莱姆病是一种全球性的蜱媒传染病，由经蜱叮咬传播的伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)感染所致[1]。20世纪70年代该病在美国首次发现，1982年Burgdorfer 从蜱类及感染患者的体内分离出伯氏疏螺旋体[2]。

我国于1985年首次在黑龙江林区内发现莱姆病患者，迄今全国各省/自治区/直辖市(含台湾地区)均有莱姆病病例报告[3]，同时也从可疑莱姆病病人血清中检测出抗体阳性[4]。衢州市目前尚无典型莱姆病病例报告，但有明确的血清抗体阳性的疑似病例报道，人群中存在莱姆病感染[5]，并且衢州市有明确的蜱及蜱媒传染病分布[6]报道。

为深入研究莱姆病螺旋体在我市鼠类中的感染情况，间接评估莱姆病的感染风险，我们采集衢州市部分县区的鼠类标本开展莱姆病螺旋体核酸检测。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 标本采集 2014-2017年，在柯城、开化乡镇的农田、山林处捕获鼠类，经无菌解剖后，取鼠脾置于无菌冻存管中，于-80 ℃存放。

1.1.2 试剂 TIANGEN血液/组织/基因组DNA提取试剂盒(cat#DP304-03)；DreamTaqTMGreen PCR Master Mix (2X) 预混反应体系(Thermo K1082)。

1.1.3 仪器 宁波新芝Scientz-48高通量组织破碎仪，Eppenderf5425高速离心机, BIO-Rad扩增仪，BIO-Rad HE-120en电泳仪,BIO-Rad Chemi DocTMXRS+凝胶成像系统。

1.1.4 巢式PCR扩增引物靶序列 莱姆病螺旋体核糖体5s-23s基因间隔区(第1轮23s3/23sa，第2轮23s5/23s6)。见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 取鼠脾10 mg左右，采用组织破碎仪破碎后制成细胞悬液，按TIANGEN(cat#DP304-03)提取试剂盒说明书对样品进行DNA提取。-40 ℃保存，备用。

1.2.2 巢式PCR检测 采用30 μL 反应体系，第1轮反应体系:2×Mix 15 μL，上游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL， 下游引物(10.0 μmol/L)0.8 μL，模板3.0 μL，ddH2O 10.4 μL，总体积30.0 μL 体系。第2轮反应体系: 2×Mix15 μL，上游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL， 下游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL，模板1.0 μL，ddH2O 12.4 μL，总体积30.0 μL 体系。反应条件：第1轮PCR为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环后；72 ℃ 延伸10 min；然后降温到4 ℃保存。第2轮PCR反应为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环后；72 ℃ 延伸10 min；然后降温到4 ℃保存。

1.2.3 PCR产物检测 巢式PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶140 V电泳30～40 min，在凝胶成像仪成像拍照。阳性片段为253 bp左右。

1.2.4 测序及序列分析 将PCR产物送生工生物上海有限公司测序，使用Lasergen软件经序列分析并在NCBI网站应用Blast对序列进行比对。与下载的同源性高且正式发表的序列用 MUSCLE(v3.8.31)软件对提供的核酸序列进行多重比对。将比对后的序列采用fastree(version 2.1.11)软件中的 Maximum Likelihood 法构建系统发育树，对系统发育树分支的可靠性进行验证(bootstrap，1 000 replications)。

2 结 果

2.1 鼠类分布 2014-2017年在柯城区、开化县两个采集点共捕鼠378只，其中，黑线姬鼠127只、褐家鼠88只、黄胸鼠67只、社鼠49只、针毛鼠33只、臭鼩鼱5只、白腹巨鼠3只、黄鼩2只、青毛鼠2只、东方田鼠2只，分别占捕获总数的33.59%、23.28%、17.72%、12.96%、8.73%、1.32%、0.79%、0.53%、0.53% 和0.53%。黑线姬鼠、褐家鼠和黄胸鼠为优势种，占总数的74.6%。

2.2 巢式PCR 对采集的378份鼠脾标本用TIANGEN血液/组织/基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，用23 s 3/23 s a和23 s 5/23 s 6两组引物进行两轮PCR检测。在59份标本中获得阳性结果。不同年份、不同鼠种莱姆病核酸阳性结果见表2、表3。

表2 2014-2017年莱姆病螺旋体核酸阳性结果Tab.2 Positive nucleic acid results of Borrelia burgdorferi from 2014 to 2017

表3 不同鼠种莱姆病螺旋体核酸阳性结果Tab.3 Positive nucleic acid results of Borrelia burgdorferi from different rodent species

2.3 测序结果和基因型 选取典型的37条序列分别通过NCBI 网站中的 blastn 软件进行比对，发现它们与GenBank 中伯氏疏螺旋体菌株的 5S～23S rRNA基因间隔区序列具有高度同源性。在37份样本扩增序列中，有26份阳样本为Borreliagarinii(B.g)基因型；有8份阳性样本为Borreliavalaisiana(B.v)基因型；有3份阳性样本为Borreliaspielmanii(B.sp)基因型。其中，2014年柯城区采集的样本全部为B.g基因型，2015年开化县采集的样本有B.v基因型和B.g基因型，2016、2017年度开化县采集的样本均为B.v基因型。不同年份、地点采集的样本基因型见表4。

表4 不同年份地点莱姆病螺旋体基因型Tab.4 Genotypes of Borrelia burgdorferi in different years and locations

2.4 系统发育树重构 对本次检测阳性样本，选取37条典型的序列用 MUSCLE(v3.8.31)软件进行多重比对。将比对后的序列采用fastree(version 2.1.11)软件中的 Maximum Likelihood 法构建系统发育树，对系统发育树分支的可靠性进行验证(bootstrap，1000 replications)，结果见图1。

图1 浙江省衢州地区鼠类携带莱姆病螺旋体的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Borrelia burgdorferi in rodents in Quzhou area, Zhejiang

3 讨 论

莱姆病作为近年来新发的蜱媒传染病，已成为全球公共卫生问题[7]。

莱姆病螺旋体的贮存宿主较多，鼠类是其重要的贮存宿主之一。检测鼠类莱姆病螺旋体病原体伯氏疏螺旋体感染情况，对防控人莱姆病具有重要意义。目前为止，世界上所分离到的伯氏疏螺旋体菌株不断增加，2009年报道有14个基因型[8]，目前已报道至少有22个基因型[3]，其中已确定对人有致病性的有4个基因型[9]Borreliaburgdorferisensustricto、Borreliagarinii、Borreliaafzelii及Borreliaspielmanill。而Borreliavalaisiana基因型莱姆病螺旋体的致病性也有不同的报道，部分研究认为Borreliavalaisiana基因型莱姆病螺旋体也有致病性[10]。

本次采用巢式 PCR方法检测莱姆病螺旋体，灵敏度、特异度均比较高[11-12]。378份鼠脾标本莱姆病螺旋体核酸阳性59份，阳性率为15.61%，在对选取的37条序列通过 blastn 软件比对，发现衢州地区的莱姆病螺旋体有3个型别，其中Borreliagarinii型占70.3%，Borreliavalaisiana型占21.6%，Borreliaspielmanii型占8.1%。在不同年份、地点采集的鼠标本中，莱姆病螺旋体的基因型各不相同，在2014年柯城区采集的样本中检出的均为Borreliagarinii型，2015-2017年开化县采集的样本中检出的为Borreliavalaisiana型和Borreliaspielmanii型。提示衢州地区的莱姆病螺旋体型别相对比较丰富，这也与衢州地区低山丘陵地形为主以及开化县打造国家公园，拥有大片的原始森林，森林覆盖率达到80%以上有关，是一个天然的生物基因库，宿主动物和媒介生物种类繁多,病原体的基因型与媒介、宿主之间的关系有待今后继续探究。

随着经济的发展，这些地区的外来人员增多，完全无免疫力的人员进入，可能会对人群健康构成威胁，应引起高度重视。

利益冲突：无

引用本文格式：张建民，占炳东，陈旭富，等. 浙江省衢州地区鼠类携带莱姆病螺旋体研究[J].中国人兽共患病学报，2021，37(11)：1053-1056. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.149