微小RNA-335-3p靶向小鼠双微体基因调控骨髓瘤细胞的增殖和凋亡

于云祥，龚泰芳，刘小涛，柯文，李彬彬

骨髓瘤是一种骨髓内单克隆浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，其发病率呈增长趋势，极大威胁人类生命健康。骨髓瘤的治疗主要以药物治疗、造血干细胞移植术为主。目前，骨髓瘤的发病机制尚未明确，临床治疗疗效不佳。探讨骨髓瘤发生和发展的分子机制并寻找该疾病的治疗靶点具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一类非编码RNA，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命过程，在肿瘤的发生发展中起重要作用。有报道称，miR-335-3p在多发性骨髓瘤病人外周血中表达下调，外周血miR-335-3p 水平变化对骨髓瘤诊断具有重要意义。但是，miR-335-3p 对骨髓瘤发生发展的影响及其作用机制还未知。本研究于2018年5月至2019年1月主要探讨了miR-335-3p 对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的调控机制，以期为骨髓瘤的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂

骨髓瘤细胞KM3和U266细胞系购自中科院上海细胞库；胎牛血清和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂和Lipofectamine2000 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒和PCR 试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；引物序列由上海生工生物技术公司提供；miR-335-3p 模拟物（miR-335-3p mimics）以及miRNA 阴性对照购自广州锐博生物有限公司；噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma 公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液和BCA 蛋白检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；小鼠双微体基因（MDM2）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（P21）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自美国Santa Cruz 公司；B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2 相关X（Bax）蛋白抗体购自美国CST 公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1

细胞培养 复苏KM3 和U266 细胞，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基，置于二氧化碳培养箱中培养。待细胞融合至80% 左右时，进行传代。正常骨髓细胞MNC 培养：参照文献[8］方法，采集正常供髓者骨髓，肝素钠抗凝。加入37 ℃温浴的2.7% 甲基纤维素，终浓度为0.1%，置于37 ℃、5%二氧化碳、97% 湿度的培养箱中静置30 min。吸取上层有核细胞层，加入Ficoll-Hypaque 淋巴分离液，2000 r/min 离心30 min，分离MNC 细胞。磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗2 次，加入含10% 胎牛血清的培养进行培养。

1.2.2

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测细胞中miR-335-3p 表达水平 用Trizol试剂提取细胞中总RNA，逆转录为互补DNA（cDNA）后，行PCR 反应。引物序列：miR-335-3p 正向5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3'，反向5'-GGTCAG GAGCAATAATGAAAAA-3'；U6 正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。用2法计算miR-335-3p 相对U6 的表达量。

1.2.3

细胞转染 取6 孔板，加2.5 mL 对数期KM3细胞悬液（2.5×10/mL），培养12 h 后，用Lipofectamine2000 试剂盒进行转染。 miR-335-3p 组：转染miR-335-3p mimics；miR-NC 组：转染模拟对照序列；pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 组：共转染MDM2 过表达载体和miR-335-3p mimics；pcDNA3.1+miR-335-3p 组：共转染空载体和miR-335-3p mimics。转染6 h 后，更换为完全培养基。再培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.4

MTT 法检测细胞增殖 取96 孔板，加200μL上述转染后的细胞悬液（2.5×10/mL），分别培养24 h、48 h和72 h。然后加20 μL MTT（5 g/L）。孵育4 h后，弃培养基。加150 μL 二甲基亚砜溶液，振荡均匀，于全自动酶标仪490 nm波长处测吸光度。

1.2.5

流式细胞仪检测细胞凋亡取6 孔板，加2.5 mL 上述转染后的细胞悬液（2.5×10/mL），培养48 h后，收集细胞。PBS 清洗细胞3 次，利用Annexin VFITC/碘化丙啶（PI）试剂盒，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6

蛋白质印迹法（Western blotting）检测cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax 和MDM2 蛋白表达 取6 孔板，加2.5 mL 上述转染后的细胞悬液（2.5×10/mL），培养48 h 后，收集细胞，用RIPA 裂解液提取细胞中总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。行10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并用5% 脱脂奶粉室温封闭2 h。 于4 ℃冰箱中分别用cyclin D1（1∶800）、P21（1∶400）、Bcl-2（1∶600）、Bax（1∶600）、MDM2（1∶400）和GAPDH 一抗孵育过夜，洗膜后，再用辣根过氧化酶标记的二抗（1∶200）室温孵育2 h。加入化学发光试剂，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。Image J 软件分析目的蛋白相对GAPDH 的表达量。

1.2.7

双荧光素酶报告基因实验 PCR 计数扩增含miR-335-3p 结合位点的MDM2 的3’非翻译区（UTR），插入载体，构建MDM2 的3’UTR 野生型荧光素酶报告载体（WT-MDM2）；突变结合位点，插入载体，构建MDM2 的3’UTR 突变型荧光素酶报告载体（MUT-MDM2），该过程由上海生工生物技术有限公司完成。用Lipofectamine2000 试剂盒分别将WT-MDM2与miR-335-3p mimics、WT-MDM2与miRNC、MUT-MDM2 与miR-335-3p mimics 及MUTMDM2 与miR-NC 共转染至KM3 细胞。转染6 h 后，更换为完全培养基，再培养24 h 后，收集各组细胞，参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 骨髓瘤细胞系中miR-335-3p 表达水平

qRTPCR 检测结果显示，骨髓瘤细胞KM3 和U266 中miR-335-3p 表达水平分别为0.24±0.01、0.38±0.02，显著低于正常骨髓细胞MNC 中的miR-335-3p 表达水平0.77±0.03（

t

=29.029、18.735，均

P

＜0.001），

F

=484.929，

P

＜0.001。 由于骨髓瘤细胞KM3 中miR-335-3p 表达水平相对低于U266 细胞（

t

=15.340，

P

＜0.001），因此，选择KM3细胞进行后续实验。

2.2 过表达miR-335-3p 对骨髓瘤细胞KM3 增殖的影响

miR-335-3p 组KM3 细胞中miR-335-3p 表达水平为0.48±0.03，高于miR-NC 组的0.21±0.01（

t

=14.789，

P

＜0.001），说明miR-335-3p mimics 转染成功，KM3 细胞中miR-335-3p 过表达。MTT 法与蛋白质印迹法结果显示，与miR-NC 组比较，miR-335-3p组KM3 细胞培养48 h、72 h 后吸光度降低（均

P

＜0.05），细胞中cyclin D1 蛋白表达降低（

P

＜0.001），P21 蛋白表达升高（

P

＜0.05），表明过表达miR-335-3p可抑制KM3细胞增殖。见表1。

表1 过表达miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3增殖的影响/±s

2.3 过表达miR-335-3p 对骨髓瘤细胞KM3 凋亡的影响

流式细胞仪与蛋白质印迹法结果显示，miR-335-3p 组KM3 细胞凋亡率为（24.31±0.99）%，高于miR-NC 组的（8.13±0.83）%（

t

=37.573，

P

＜0.001）；细胞中Bax 蛋白表达水平为（0.71±0.07），高于miR-NC 组的（0.19±0.02）（

t

=106.066，

P

＜0.001）；Bcl-2 蛋白表达水平为（0.32±0.03），低于miR-NC 组的（0.81±0.08）（

t

=110.309，

P

＜0.001），表明过表达miR-335-3p能够促进KM3细胞凋亡。

2.4 miR-335-3p 靶向调控MDM2

TargetScan 生物信息学软件预测显示的MDM2 的3’UTR 与miR-335-3p 互补结合的核苷酸序列见图1A。共转染miR-335-3p与WT-MDM2的KM3细胞荧光素酶活性为0.47±0.03，显著低于共转染miR-335-3p 与WTMDM2 的0.97±0.05（

t

=14.852，

P

＜0.001）；共转染miR-335-3p 与MUT-MDM2 的KM3 细胞荧光素酶活性为0.96±0.08，与共转染miR-NC 与MUT-MDM2 的1.01±0.09 比较差异无统计学意义（

t

=0.719，

P

=0.512），说明miR-335-3p 可与MDM2 的3’UTR 序列结合。miR-335-3p 组MDM2 蛋白表达水平为0.14±0.02，显著低于miR-NC 组的0.63±0.06（

t

=18.981，

P

＜0.001）；anti-miR-335-3p 组MDM2 蛋白表达水平为0.97±0.06，显著高于anti-miR-NC 组的0.67±0.04（

t

=7.206，

P

＜0.001）。表明miR-335-3p在KM3细胞中靶向负调控MDM2表达，见图1B。

图1 miR-335-3p靶向调控MDM2表达：A为MDM2的3’非翻译区（UTR）与miR-335-3p互补结合的核苷酸序列；B为miR-335-3p靶向调控MDM2蛋白表达

2.5 过表达MDM2能逆转miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3 增殖的影响

与pcDNA3.1+miR-335-3p 组比较，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 组KM3 细胞培养48 h、72 h后吸光度显著升高（均

P

＜0.05），KM3细胞中cyclin D1 蛋白表达显著升高（

P

＜0.05），P21 蛋白表达显著降低（

P

＜0.05），表明过表达MDM2 部分逆转过表达miR-335-3p 对KM3 细胞增殖的抑制作用。见图2、表2。

表2 过表达MDM2逆转miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3增殖的影响/±s

图2 过表达MDM2逆转miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3增殖的影响

2.6 过表达MDM2逆转miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3 凋亡的影响

与pcDNA3.1+miR-335-3p 组比较，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 组KM3 细胞的凋亡率显著降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表达显著升高（

P

＜0.05），Bax蛋白表达显著降低（

P

＜0.05）。见表3。

表3 过表达MDM2逆转miR-335-3p对KM3细胞凋亡的影响/±s

3 讨论

miRNA 是一类小分子非编码RNA，对肿瘤的发生发展具有调控作用。研究已显示，多种miRNA 在骨髓瘤发生发展过程中起重要作用。miR-19a 在多发性骨髓瘤细胞株LP-1 和U266 中表达水平显著升高，miR-19a 能够促进骨髓瘤细胞的增殖和侵袭能力，并抑制骨髓瘤细胞的凋亡。多发性骨髓瘤病人血清中miRNA-181a 呈高表达，抑制miRNA-181a表达可降低骨髓瘤RPM18226 细胞的存活、集落形成和迁移能力。miRNA-20a在多发性骨髓瘤病人血浆中表达升高，其可促进骨髓瘤细胞的增殖，抑制骨髓瘤细胞凋亡，促进移植瘤小鼠体内肿瘤生长，是治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点。研究骨髓瘤病人机体内异常表达的miRNA 及其对骨髓瘤细胞生物学行为的影响，对了解骨髓瘤疾病发生的机制以及临床基因治疗有重要意义。

miR-335-3p 基因定位于7q32.2，参与多种肿瘤的发展进程。Luo 等研究显示，miR-335-3p 靶向下调聚（ADP-核糖）聚合酶1 表达抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和体内肿瘤生长。Wang 等研究显示，miR-335-3p 过表达对乳腺癌细胞的细胞周期进程、迁移和侵袭具有明显抑制作用。Gao 等研究显示，miR-335-3p 在胃癌细胞中表达降低，与胃癌的发生发展密切相关。目前，miR-335-3p 对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的研究还未见报道。骨髓瘤的发生与发展是瘤细胞异常增殖和凋亡抑制的结果，通过调控骨髓瘤细胞的增殖和凋亡，可以延缓骨髓瘤的发展进程。本研究结果显示，miR-335-3p 在骨髓瘤细胞KM3 和U266 中呈低表达，过表达miR-335-3p 对KM3 细胞增殖活性具有明显抑制作用，而对KM3 细胞凋亡具有明显促进作用，其可能通过间接调控增殖和凋亡相关蛋白cyclin D1、P21、Bax 和Bcl-2蛋白表达发挥作用，提示miR-335-3p可能成为骨髓瘤基因治疗的分子靶标。

miRNA 通常通过调控其靶基因的表达发挥生物学调控作用，为了进一步探讨miR-335-3p 影响骨髓瘤细胞增殖和凋亡的分子机制，本研究证实了miR-335-3p 在KM3 细胞中靶向负调控MDM2 表达。MDM2 是一种原癌基因，在膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。研究显示，下调MDM2 表达可抑制神经胶质瘤细胞的增殖和迁移。MDM2蛋白在骨髓瘤组织中表达升高，与病人临床分期正相关，可能与cmyc 蛋白协同促进骨髓瘤的发展。抑制MDM2 表达可诱导骨髓瘤细胞凋亡，过表达MDM2 可通过激活E2F-1和下调细胞周期抑制蛋白（wtp53和p21）来加速骨髓瘤细胞的细胞周期进程，促进细胞增殖。本研究显示，过表达MDM2 部分逆转了过表达miR-335-3p对骨髓瘤细胞KM3增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响，提示miR-335-3p 通过下调MDM2表达抑制骨髓瘤细胞的增殖，并促进其凋亡。

综上所述，miR-335-3p 在骨髓瘤细胞中呈低表达，其可能通过下调MDM2 表达抑制骨髓瘤细胞的增殖，并促进骨髓瘤细胞凋亡，miR-335-3p/MDM2轴可能为骨髓瘤的治疗提供了新靶点，但尚需动物模型实验在体内验证miR-335-3p/MDM2 轴对骨髓瘤发生发展的影响。