基于UPLC-Q-TOF-MS的柑普茶外果皮、鲜陈皮和鲜砂糖橘皮的全成分对比分析*

张琪，胡安琪，范倩，陈胜，肖细姬，张翠仙

广州中医药大学中药学院，广东广州 510006

柑普茶是将云南普洱茶填入新鲜新会柑中，然后经低温烘干收缩贮存而成的一种新型茶品。因其味醇甘香，口感甚佳，得到众多爱茶人士的青睐［1-2］。同时其兼具新会陈皮和云南普洱茶的功效［3］，具有保健养生的作用。新会陈皮作为国家地理标志性产品，拥有几百年的使用历史［4-5］。陈皮有广泛的药理活性［6］，最被人们熟知的就是理肺健脾、化痰生津的功效［7］，一般被用来治疗咳嗽多痰、滞食和消化不良等疾病［8］。但随着对陈皮研究的逐渐深入，人们发现陈皮还具有防止心血管疾病［9-11］、抗血小板聚集［12］、抗衰老和抗氧化作用［13］。近年来随着大家养生保健意识的加强，柑普茶更是深受人们喜爱。但柑普茶作为茶品，多以煎煮冲泡为主，尽管目前关于柑普茶溶出成分已有一些报道，但大多围绕陈皮中橙皮苷、挥发性成分或黄酮类成分展开［1，14-15］。该研究旨在对陈皮的水溶性化学成分进行综合分析，以期从整体的角度为后续柑普茶全成分研究提供理论数据支持。

1 仪器与材料

TripleTOFTM5600+型三重四级杆飞行时间质谱（美国AB SCIEX 公司）。超高效液相系统：LC-30AD 高效液相色谱仪、SIL-30AC 自动进样器（日本Shimadzu 公司）；煎煮锅（广州文新电器有限公司）； Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；卢湘仪DD-5M 低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Sartorius 赛多利斯十万分之一天平（季尔国际贸易有限公司）。甲醇（色谱纯，德国Merck 公司），超纯水（广州中医药大学中药学院实验平台自制），乙腈（色谱纯，德国默克Merck 公司）。柑普茶为市售新会产柑普茶（批号2016-1，3 年品）和鲜新会陈皮（批号2019-X1）均购自广州靳宝堂茶叶有限公司，鲜砂糖橘皮（购自市场，批号2019-1）。

2 方法与结果

2.1 实验条件

2.1.1 色谱条件ACE C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：φ=0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～2.5 min，90%～70% A；2.5～11.5 min，70%～10% A；11.5～16 min，0% A；PDA 全波长扫描；柱温30 ℃；体积流量0.7 mL/min；进样量4 μL。

2.1.2 质谱条件采用电喷雾离子化源（ESI），采用正离子扫描模式，扫描范围m/z100～1 500，用脑啡肽作校正液，进行实时校正。正离子模式离子喷雾电压（ISVF）：+5 500 eV；涡轮喷雾温度（TEM）：550 ℃；气帘气压力（GUR）：35 psi；雾化气（Gas1）：55 psi；辅助气（Gas2）：55 psi；解簇电位（DP）：100 V；碰撞能量（CE）：30 eV；碰撞能散布（CES）：15 eV；离子释放延迟（IRD）：67 eV；离子释放宽度（IRW）：25 eV；一级质谱母离子扫描范围100～1 500；IDA 设置响应值超过100 cps 的8 个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围：100～1 500。

2.2 供试品溶液的配置

分别取适量干燥的柑普茶外果皮药材（PGT）、鲜新会陈皮（CRC）和鲜砂糖橘皮（CT），粉碎后过2号筛。精密称定3种样品粉末各15.0 g 置于圆底烧瓶中，加入蒸馏水1 500 mL 并加热回流提取5 h，静置冷却后用双层纱布过滤，再浓缩并配置成10 mg/mL 的样品溶液。取1 mL 溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液备用，等待进行LC-MS检测。

2.3 数据分析

2.3.1 数据库建立使用Peak ViewTM软件（版本1.2，AB SCIEX）对陈皮中水溶性成分进行定性鉴别。首先，通过检索相关文献和化学数据库网站（CNKI、Chemspider、Web of Science、PubMed 和SciFinder 等），建立了一个属于陈皮的化合物数据库，包括名称、分子式和化学结构式文件。

2.3.2 数据分析将数据库导入到Peak ViewTM软件的XIC Manager 模块对目标化合物进行峰提取和匹配。提取参数设置如下：XIC intensity ＞50 counts，S/N ＞10，isotope ratio% difference ＜20，mass error ＜10×10-6。经计算筛选后，软件将各化合物的实测数据与软件理论的数据进行匹配，将匹配度大于75%且质谱碎片裂解过程合理的结果作为陈皮中最终鉴别出来的化合物。

3 结果与结论

将供试品溶液按2.1项下检测条件注入UPLCQ-TOF-MS 系统进行分析，得到PGT、CRC 和CT提取物正离子模式下的基峰图（图1）。对CRC 的目标化合物色谱峰进行提取和匹配，共有94 个色谱峰具有较完备的质谱数据。通过与相关参考文献MS2数据进行比对，并结合质谱碎片离子信息及根据其推导出的质谱裂解规律，对图谱PGT 中47个、CRC中72个和CT中56个色谱峰的化学结构进行鉴定。鉴定结果为黄酮类（PGT：44 个、 CRC：63 个、CT：50 个）、柠檬苦素类（PGT：1 个、后二者均4 个）、香豆素类（仅CRC：2 个）、生物碱类（PGT：1 个、CRC：2 个、CT：1 个）及环肽类化合物（均1 个）（见表1）。三者差异性成分主要体现在多甲氧基黄酮类成分和香豆素类成分上。

表1 PGT、CRC和CT的UPLC-Q-TOF-MS化学成分分析1）Table 1 Chemical Constituents of PGT，CRC and CT by UPLC-Q-TOF-MS

图1 PGT、CRC和CT提取物在正离子模式下的基峰图Fig.1 Base Peak Chromatogram(BPC)of extracts of PGT,CRC and CT in positive ion mode

3.1 黄酮（苷）类成分鉴定

PGT 的水提液中共鉴定到44 个黄酮类成分，包括4 个黄酮苷类和40 个多甲氧基黄酮类成分；CRC 的水提液中共鉴定到63 个黄酮类成分，包括17 个黄酮苷类与46 个多甲氧基黄酮类成分，其中黄酮苷类成分含量相对较高，而多甲氧基黄酮类成分的化学结构更多样。CT 中则鉴定50 个黄酮类成分包括33 个多甲氧基黄酮类成分和17 个黄酮苷类成分。而CRC 和CT 二者鉴定的黄酮苷类化合物主要为氧苷和碳苷两大类，且一般链接1～2 个糖基。黄酮氧苷类化合物包括1 个7 位单糖基黄酮氧苷类（16）、8 个双糖基黄酮氧苷类化合物（7、8、9、12、13、20、22和27），而黄酮碳苷类化合物则包括2个单糖黄酮碳苷类（11 和19）与4 个双糖黄酮碳苷类化合物（2、5、6和10）。以橙皮苷（Hesperidin 13）与Lucenin-2（2）为例分别阐述黄酮氧苷和黄酮碳苷类化合物的裂解途径。

化合物13 为典型的7 位黄酮氧苷类化合物，在正离子模式下的准分子离子峰为[M+H]+m/z611.197 6，分子式C28H34O15。MS2图谱中出现糖苷键断裂产生的标志性碎片离子峰[M+H-Rha]+m/z465.138 6（图2-Y 裂解，即脱去糖基而保留羟基），[M+H-Rha -O]+m/z449.144 4（图2-Z 裂解，即同时脱去糖基和羟基） 与[M+H-Rha-Glc]+m/z303.085 7。由此可推断该化合物为双糖黄酮氧苷类化合物。MS2图谱中的碎片离子峰[M+H-Rha-O-18]+m/z431.134 0 与[M+H-Rha-O-54]+m/z395.112 5推测为[M+H-Rha-O]+碎片离子峰进一步裂解丢失H2O（18）所产生的。此外，MS2图谱中还存在大量由于黄酮苷元母核C 环1，3 键发生RDA 裂解产生的1，3A 碎片离子峰[M+H-Rha-C9H10O2]+m/z315.086 0,[M+H-Rha-Glc-C9H10O2]+m/z153.017 8 等及其后续连续丢失H2O(18)所产生的碎片离子峰[M+H-Rha-O-C9H10O2-H2O]+m/z281.065 8、 [M+H-Rha-O-C9H10O2-2H2O]+m/z263.054 8 和[M+H-Rha- O-C9H10O2- 3H2O]+m/z245.044 1 等进一步证明13 推断无误。碎片离子信息与文献［16-18］研究一致，推断其为橙皮苷（图2）。

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由鉴定结果分析可知：黄酮氧苷类化合物在正离子模式下以发生糖苷键断裂（图2 中Y 裂解或Z 裂解）为特征性裂解方式，常见的碎片离子丢失包括C6H10O4（146）、C6H10O5（162）和C6H10O6（178）等。其苷元结构可继续丢失CH3+（15）和CO（28）等碎片，或在黄酮苷元C 环1，3 键位置发生RDA 裂解，此类裂解规律可作为黄酮氧苷类化合物结构的重要鉴别途径。

图2 橙皮苷的质谱裂解途径Fig.2 Mass spectrometric cracking pathway of Hesperidin

化合物2为典型的6，8-碳苷黄酮类化合物，在正离子模式下[M+H]+m/z611.161 6，分子式为C27H30O16。MS2图谱中出现碎片离子峰[M+H-18]+m/z593.156 4，[M+H-36]+m/z575.142 2，[M+H-54]+m/z557.128 3，[M+H- 72]+m/z539.119 1 和[M+H-90]+m/z521.109 1 推测由准分子离子峰连续丢失H2O（18）产生；同时出现碎片离子峰[M+H-324]+m/z287.052 3，推测由准分子离子峰丢失两分子葡萄糖基（C6H10O5，162）所得。此外，MS2图谱中出现碎片离子峰[M+H-120]+m/z491.107 9，符合黄酮碳苷己糖六元环0，2 键开环裂解，丢失C4H8O4（120）的特点。碎片离子峰[M+H-2C4H8O4]+进一步裂解可得到连接于黄酮苷元上的糖残基丢失H2O（18）与CO（28）产生的碎片离子峰[M+H-2C4H8O4-H2O]+m/z353.066 3 和[M+H-2C4H8O4-H2O-2CO]+m/z299.052 8，由此可进一步确认该化合物为双糖黄酮碳苷类化合物，碎片离子峰信息与文献［16-18］研究一致，推断其为Lucenin-2（图3）。

综合分析发现：黄酮碳苷类化合物在正离子模式下以连续中性丢失H2O 碎片为主，常见糖环的开环裂解（图3-X 裂解）与其残留基团中性丢失H2O（18）与CO（28）等碎片。糖环的0，2 键开环裂解是黄酮碳苷的特征裂解形式，己糖中性丢失C4H8O4（120），戊糖中性丢失C3H6O3（90），此类裂解规律可作为黄酮碳苷类化合物结构的重要鉴别途径。

图3 Lucenin-2 的质谱裂解途径Fig.3 Mass spectrometric cracking pathway of Lucenin-2

同时PGT、CRC 和CT 的水提液中共鉴定到40、46 个和33 个多甲氧基黄酮苷元类化合物。以3，5，6，7，8，3΄，4΄-七甲氧基黄酮（3，5，6，7，8，3΄，4΄-Heptemethoxyflavone，63）为例阐述多甲氧基黄酮类化合物的裂解途径。化合物63 在正离子模式下的准分子离子峰为[M+H]+m/z433.147 7，分子式C22H24O9。 MS2图谱中出现碎片离子峰[M+H-30]+m/z403.099 8 与[M+H-45]+m/z388.077 9，推测由准分子离子峰连续丢失CH+（15）所产生；同时出现碎片离子峰[M+H-16]+m/z417.116 1，推测由准分子离子峰丢失CH4（16）得到。MS2图谱中出现大量以[M+H -nCH3]+为基础进一步丢失CO（28）及H2O（18）碎片离子峰如： [M+H-3CH3- CO]+m/z360.083 0、[M+ H-4CH3-CO]+m/z345.059 1、[M+H-4CH3-CO-H2O]+m/z327.051 2、 [M+H-4CH3-2CO]+m/z317.064 1、[M+H-4CH3-2CO- H2O]+m/z299.054 6、[M+H-4CH3-3CO]+m/z289.069 9、[M+H-4CH3-3CO-H2O]+m/z271.059 5 和[M+H-4CH3-4CO-H2O]+m/z243.064 4 等。由此可推断该化合物为多甲氧基黄酮类化合物。此外，MS2图谱中还出现碎片离子峰[M+H-267]+m/z165.053 7 推测为多甲氧基黄酮C 环0，2 键发生裂解，丢失C13H15O6（267）生成的0，2B 碎片。0，2B 碎片丢失CO（28）得到碎片离子峰[M+H-C13H15O6-CO]+m/z137.059 0。而碎片离子峰[M+H-192]+推测由于多甲氧基黄酮C 环1，3 键发生RDA 裂解导致1，3B 碎片（C11H12O3）丢失，此后继续丢失CH3+(15)与CO (28)得到[M+HC11H12O3-2CH3]+m/z211.023 9、 [M+H-C11H12O3-2CH3-CO]+m/z183.028 8 等碎片离子峰。质谱信息与文献［19-20］研究一致，推断其为3，5，6，7，8，3΄，4΄-七甲氧基黄酮。正离子模式下3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮可能的质谱裂解途径见图4。多甲氧基黄酮类化合物在正离子模式下以连续丢失C碎片为特征裂解方式，后续可见丢失H2O 和CO，同时黄酮母核C环发生1，3键RDA裂解或0，2键开环裂解。

图4 3，5，6，7，8，3΄，4΄-七甲氧基黄酮的质谱裂解途径Fig.4 Mass spectrometric cracking pathway of 3,5,6,7,8,3΄,4΄-Heptemethoxyflavone

3.2 柠檬苦素类成分的鉴定

从PGT 中仅检测到一个柠檬苦素类化合物（52），而CRC 和CT 的水提取物中则均鉴定到4 个柠檬苦素类成分，包括诺米林酸（Nomilinic acid 34）、柠檬苦素（Limonin 52）、诺米林（Nomilin 60）和Limonexic acid（71）。以诺米林为例阐述柠檬苦素类化合物的裂解途径。

化合物60 正离子模式下准分子离子峰为[M+H]+m/z515.228 8，分子式为C28H34O9。MS2图谱中出现碎片离子峰[M+H-46]+m/z469.228 5，暗示其由准分子离子峰同时脱去一分子H2O（18）和CO（28）产生。同时[M+H-78]+m/z437.193 6 和[M+H-96]+m/z419.191 7 则由准分子离子峰丢失CH3COOH（60）后连续丢失两分子H2O（18）产生，[M+H-C2H4O2-2H2O]+进一步裂解产生碎片离子峰[M+H-124]+m/z391.195 5，推测丢失CO（28）所得。此外，MS2图谱中出现高强度碎片离子峰m/z161.060 9，推测由准分子离子峰在高能碰撞轰击下直接丢失C18H26O7（354）所得。柠檬苦素类化合物［21］出现碎片离子峰m/z161.06 是呋喃环连接内酯环断裂后留下的残基，而CH3COOH（60）的丢失可能是由于发生了McLafferty 重排，确定其为柠檬苦素类化合物，推断其为诺米林［21］，正离子模式下诺米林的质谱裂解途径见图5。

图5 诺米林的质谱裂解途径Fig.5 Mass spectrometric cracking pathway of Nomilin

3.3 生物碱类成分的鉴定

从CRC 鉴定到2 个苯乙胺生物碱类化合物，分别为N-乙酰章鱼胺（N-acetyl octopamine，3）和辛弗林（Synephrine，4）。而PGT 中仅检测到了3，CT 中仅检测到了4。以辛弗林4 为例阐述生物碱类化合物的裂解途径。4 在正离子模式下的准分子离子峰为[M+H]+m/z168.101 8，分子式为C9H13NO2，MS2图谱中出现高丰度碎片离子峰[M+H- 18]+m/z150.092 3，推测由准分子离子峰丢失一分子H2O（18）产生。同时MS2图谱中可见碎片离子峰[M+H-33]+m/z135.069 4，推测由准分子离子峰丢失一分子H2O（18）后发生α-断裂脱去侧链C（15）所产生。此外还见碎片离子峰[M+H-H2OCH3-14]+m/z121.065 1 与[M+H-H2O-CH3- 26]+m/z109.065 5，推测由碎片离子峰[M+H-H2O-CH3]+分别脱去N(14）或CN（26）所产生。碎片离子信息与文献［22］研究一致，由此可推断其为辛弗林，其正离子模式下可能质谱裂解途径见图6。

图6 辛弗林的质谱裂解途径Fig.6 Mass spectrometric cracking pathway of Synephrine

3.4 其他类成分的鉴定

此外从三者中均初步鉴定了环肽类化合物Citrusin Ⅲ（25），PGT 和CRC 中鉴定出简单香豆素类化合物东莨菪内酯Scopoletin（17），CT 中鉴定出呋喃香豆素类化合物佛手酚（Bergaptol 1）。

4 讨 论

UPLC-Q-TOF-MS 可以在合适液相条件分离基础上，通过分析质谱碎片信息快速鉴定物质中含有的低含量成分。同时UPLC-Q-TOF-MS 的非数据依赖性采集技术（IDA）能够无遗漏、无差异地获得样本中所有成分的全部碎片信息而不会造成低丰度离子信息的丢失，并且具有扫描点数均匀、定量准确、数据可回溯性等优点［23］，为化合物准确鉴定提供了重要信息。柑普茶目前在市场上广泛流通，不仅具有甘香浓郁的茶香更兼有陈皮药理保健作用。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS 技术对柑普茶外层陈皮和鲜新会陈皮的水煎煮液进行全成分分析，从柑普茶外果皮水煎煮液中初步鉴定了47 个成分、鲜陈皮中鉴定72 个成分，而从鲜砂糖橘皮水煎液中仅分析出56 个成分。主要为多甲氧基黄酮类成分（40 个、46 个和33 个）而黄酮苷类成分三者明显存在差异，在柑普茶外果皮中仅鉴定出4个黄酮苷类成分，而二者鲜果皮中均鉴定出17 个。鲜果皮中均首次检测到柠檬苦素类（34、52、60 和71） ，但在柑普茶外果皮中仅检测到1个柠檬苦李素类成分。同时也未在柑普茶外果皮中检测到香豆素类成分。Zheng 等［17］采用相同方法对42 批次陈皮鉴定的特征成分对比发现，黄酮及其苷类化合物种类数量相似，柑普茶外果皮检测到的多氧基黄酮苷元类成分与多批次陈皮中鉴定的成分种类和数量相似，而鲜砂糖桔此类成分明显减少。对于生物碱类成分而言，柑普茶外果皮检测到的生物碱成分仅为1个，而鲜新会陈皮检测到2 个，而砂糖橘外果皮也检测到1 个，明显比42批次陈皮的生物碱种类数量（4个）少。此现象是否与柑普茶的制作方式有关，有待进一步研究。通过本研究也发现砂糖橘外果皮与柑普茶外果皮化学成分具有较大差异，是否可以晒制成类似柑普茶一样的茶品值得进一步探讨。本研究为进一步深入研究柑普茶全成分分析提供理论数据，对后续柑普茶的化学成分和药理活性研究的深入研究提供了理论支撑。