徐州地区土壤中放线菌的分离鉴定

◇江苏省徐州医药高等职业学校 郭庆宇 朱中原 陈 曦

采集徐州范围不同类型土壤，从中分离培养放线菌。统计各类型土壤样本中放线菌含量及种类，发现链霉菌占大多数，还有部分小单孢菌类。农作物地和植物地及城市荒地中放线菌含量丰富，在沙地等贫瘠土地中含量较少。挑出有特点的菌落进行单菌种培养，得到一株稀有放线菌，用埋片法观察该株放线菌形态特征，并做电镜扫描，初步鉴定为小双孢菌。将此菌株接种在不同常规培养基上，发现在各种培养基上均能生长，但未产生可溶性色素。

放线菌种类繁多，代谢功能各异，是非常有实用价值的一类菌，受到极大重视[1]。当前发现的放线菌只占自然界的10%～20%，所以改进分离方法、寻找新的放线菌，是放线菌资源调查开发的一个重要方面[2]。土壤是放线菌习居的良好场所，土壤理化性质和土壤形成的环境条件强烈影响并决定着土壤放线菌的种类、数量及生理生化性质[3]。

1 研究内容

从徐州地区采集不同类型的土壤样本，选择性培养放线菌，从中筛选长势良好的放线菌，并进行定向富集培养，鉴定菌种，总结不同土壤中放线菌含量与种类的规律。

2 实验设计

2.1 实验仪器

HZQ-C 空气浴振荡器，电子天平，无菌工作台，1 mL、10 mL移液管，40 μL、100 μL微量注射器，全自动压力蒸汽灭菌锅，100目筛。

2.2 实验试剂

硫酸镁，硫酸亚铁，硝酸钾，磷酸氢二钾，氯化钾，硫酸铵，碳酸钙，重铬酸钾，琼脂，可溶性淀粉，蔗糖，葡萄糖，牛肉汁，酵母浸膏。

2.3 实验设计

（1）土样采集。选择江苏徐州范围内不同类型土壤，挖出地表土以下约5厘米土壤，装入洁净信封，共采集12处土样。

（2）土样处理。①风干粉碎。将采集好的土样进行编号，分别为1～12号，室温下风干10填。土样风干可以大大降低细菌的数量。风干后，将土样研成细粉状，过100目筛，每份10克，备用。②土样干热。放线菌的孢子一般比非产芽孢的细菌抗热性要强，120 ℃加热1 h就会迅速减少细菌和部分链霉菌的数量，而小双孢菌和链孢囊菌只有轻微减少。因此，将土样在120 ℃恒温箱中干热处理1小时。

（3）放线菌分离培养。①土样稀释液配制。取洁净试管48支，每4支为一组，共12组。每只试管加蒸馏水9 mL，121.3 ℃灭菌。先将1号土放入第一组试管的第一支中，震荡混匀，待稍沉淀后，用1 mL无菌移液管取1 mL土壤悬液加入第二只试管中，震荡摇匀后再取1 mL加入第三只试管，第四只类推。所以第三只、第四只试管分别是该土样的103、104稀释液。按上述方法，分别用12份土样做成稀释液。②放线菌分离培养。重铬酸钾能强烈抑制细菌和真菌的生长，而放线菌几乎不受影响。在高氏一号琼脂培养基每500 mL中加入重铬酸钾抑制剂0.4 mL，灭菌后倒平板。用1 mL无菌移液管分别吸取上步中103、104稀释液0.2 mL，每种浓度的稀释液涂2个平板，每一份土样涂4个平板，总计48个平板。

将涂布好的平板在28 ℃恒温环境培养7天，平板上长出各种放线菌菌丝，对每种土壤中放线菌的数量和种类进行统计。

（4）稀有放线菌的初筛。配制燕麦琼脂培养基1800 mL，灭菌，分装270个试管斜面。用接种针从前一阶段涂布培养的平板上挑取形状奇特、生长较小或产生色素的放线菌，将其接种在试管斜面上。每份土挑取10～20份菌，并编号，28 ℃恒温培养7天。

（5）稀有放线菌的扩大培养。在燕麦琼脂培养基平板上，将筛选出的稀有放线菌进行涂布，每种涂布两个平板。每种再用两个平板做埋片法培养，28 ℃恒温培养7天，进行稀有放线菌的形态观察及生理生化测定。①形态观察。将用埋片法培养的放线菌盖玻片取下，于载玻片上用光学显微镜和电子显微镜分别观察形态特征和培养特征，形态特征记录菌丝形态，气生菌丝和基内菌丝生长情况；菌丝体是否产生孢子丝及孢子丝的排列方式、形状；孢子丝形状和大小；孢囊的有无、形状、大小及形成方式等。培养特征记录孢子丝、菌丝颜色及是否产生可溶色素。②生理生化测定。使用高氏一号琼脂培养基、察氏琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、贝奈特琼脂培养基、酵母膏麦芽膏琼脂培养基及无机盐淀粉琼脂培养基平板，用平板划线法将分离出的稀有放线菌分别接种在以上平板上，每种培养基两个，28 ℃恒温培养7天，观察放线菌在不同培养基平板上的生长状况并作出统计。

3 实验结果

3.1 分离培养结果

使用高氏一号培养基培养分离放线菌，28 ℃培养7天后，观察到培养基上长满各种放线菌菌落，直径较小，大多数产生色素，见图1。

图1 分离出的土壤放线菌

取稀释104倍的平板对每种土壤样本放线菌菌落进行计数，并初步分类，见表1。

表1 每种土壤样本放线菌数量和分类

表中Mim代表小单孢菌放线菌类群，Acm代表马杜拉放线菌类群，Apl代表游动放线菌类群，Str代表链霉菌。

对表1中的数据进行分析，首先将12种样本分为荒地、沙地、农作物地和普通植物地四种土壤类型，分别作其中放线菌含量和种类的统计，见表2。

表2 不同土壤类型放线菌含量和种类比例

由表2可以看出，荒地的土壤放线菌含量最高，达到130×104个/克土。农作物地和城市普通植物地的放线菌含量也较高，分别为84×104个/克土和31.33×104个/克土，而沙地中放线菌含量极微，只有5×104个/克土。原因是沙地土壤贫瘠，营养成分少，不利于放线菌生长。农村农作物地和城市中普通植物地由于肥料充分，放线菌生长较好。而城市荒地多为草皮覆盖，有较多的养分积累，放线菌生长也较好。四种类型土壤中链霉菌占大多数，其次是小单孢菌类和马杜拉菌类，游动放线菌类最少。并且后两种菌类在沙地土壤中未检出。

3.2 稀有放线菌初筛结果

用接种针挑取形状奇特、生长较小或产生色素的放线菌，接种在燕麦琼脂培养基试管斜面上。每份土挑取10～15份菌，编号，共挑取153个放线菌。恒温培养后，对长成的放线菌进行鉴定，得到1株类似稀有放线菌，在5号土壤中，编号为01号菌。

3.3 稀有放线菌形态特征和生理生化性质

培养7天后，观察各种菌在燕麦琼脂培养基平板上生长情况如下：

气生菌丝乳白色，茂盛。基生菌丝少，乳白色。无可溶色素。

将使用埋片法培养的01号菌种标本进行电镜观察，拍摄到的电镜图片如图2所示。

图2 01号放线菌扫描电镜图

将01放线菌制片后放光镜下观察，形态特征如下：

单轴分枝的气丝上形成纵队排列的双孢子，孢子表面光滑，呈半球形，向内凹陷，交替生长在侧枝两侧，经电镜观察，气生菌丝直径0.2 μm～0.3 μm。初步鉴定为小双孢菌。

将01号菌分别在几种常用培养基上用平板划线法进行接种，28 ℃恒温培养7天后，观察在各平板上生长状况如表3所示。

表3 01号放线菌在不同培养基上的生长状况

4 结论

（1）从徐州地区土壤样本分离出土壤放线菌，经分类统计其大多数属于链霉菌类，有一部分小单孢放线菌类，有少量马杜拉放线菌类和游动放线菌类。城市荒地和种植作物的土壤放线菌含量多，沙地放线菌含量稀少。

（2）从分离出的放线菌中得到1株稀有放线菌，经单菌种培养并电镜鉴定为小双孢菌类，可能为新种，需进一步分析。

（3）将此种菌分别在不同培养基上培养，发现在绝大多数培养基上长势良好。