蛇床子素抑制NLRP3炎症体及对血管性痴呆大鼠的神经保护作用研究

张 放 汪玲红 王祥云 黄 樱

（赣南医学院第一临床医学院，江西 赣州 341000）

0 引言

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是可导致认知障碍的一类疾病，产生的机制主要有细胞焦亡（Pyroptosis）、中枢胆碱能系统的破坏、炎症反应、氧化应激损伤等[1]。其中，细胞焦亡与VD发病的关系渐受关注。研究表明，细胞焦亡的发生发展始于Caspase-1的激活，而Caspase-1的激活受NOD样受体（NLR）的调控。构成NLRs的关键成员：NOD样受体家族热蛋白结构域3（NLRP3），被认为是将血管疾病与神经炎症和脑部疾病紧密联系的枢纽，在其中发挥着重要作用[2]。

蛇床子素（Osthole）是一种呋喃香豆素，具有抑制抗氧自由基损伤、抗炎及改善记忆的作用[3，4]。既往发现，皮层组织中的NLRP3炎性体在慢性脑缺血的炎症反应中起着关键作用。本文从动物体内实验着手，探讨蛇床子素是否能通过抑制NLRP3炎性体激活而抵抗痴呆，进而深入探讨蛇床子素的机制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用洁净环境成长的雄性SD大鼠（重量150～180 g，n=30，赣南医学院SPF动物房供给的健康大鼠）。

1.2 药物、试剂和仪器

凝胶成像仪、电泳仪（Bio-Rad）；蛇床子素粉剂（成都埃法生物科技有限公司）；PCR仪（ABI）；NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin（Abcam）。

1.3 实验动物造模、分组及给药

用改良的两侧颈总动脉永久性结扎术制备VD动物模型。随机将大鼠平均分为五组：假手术、VD模型、蛇床子素干预组（10，25，40 mg/kg）。鼠麻醉苏醒后向其腹腔注射药物，1天1次，共给药12周。其余组生理盐水同法等量给予。

1.4 Morris水迷宫测试

能够成功找到水中台子的规定时间是120 s。大鼠找到台子实际所需的时间是逃避潜伏期（EL）。

1.5 荧光实时定量PCR

总RNA用Trizol加至组织样本来提出，加逆转录试剂，反应体系为20μL，置于仪器中反应扩增。引物设计及合成由公司完成（上海生工生物）。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）

加RIPA裂解大鼠海马组织，四度离心机处理，上清用于后续操作；以BCA（bicinchoninic acid）方式定量蛋白。SDS-聚丙烯酰胺胶（10%～12%）分离，转膜后蛋白封闭1 h，4度冰柜一抗过夜，于室温孵二抗1 h，常规化学法显影。

1.7 统计学方法

数据统计用SPSS23.0，计量资料的结果用均数±标准差呈现。单因素方差分析统计各个组之间数据，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 蛇床子素对VD大鼠认知功能的作用

定位航行结果显示，VD组大鼠EL（46.6438.371s）较假手术组（23.0245.125s）时间延长（P<0.05）；蛇床子素治疗各组大鼠的EL与VD组相比均缩短，但仍高于假手术组；治疗组组间比较提示，中剂量组大鼠的EL（36.3302.534s）、高剂量组大鼠的EL（34.2254.326s）显著低于低剂量组大鼠的EL（40.2892.112s），P<0.05；但蛇床子素高、中两组EL相比，P>0.05。

2.2 蛇床子素对VD大鼠海马组织中IL-1β、caspase-1、IL-18、NLRP3的mRNA和蛋白表达的影响

PCR结果显示（见表1），VD组海马中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的表达较假手术组增加；蛇床子素各组与VD组相比，可明显抑制以上所述mRNA的表达量，P<0.05。

表1 各组大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的相对表达量

通过Western blot实验（见表2），VD组较假手术组海马中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白表达增加。同时，低剂量组海马中的上述蛋白的表达与VD组相比均减少，而中、高两组减少地更明显，P<0.05。

表2 各组大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白的相对表达量

3 讨论

研究报道，在正常细胞内环境中，NLRP3会抑制其自身的寡聚化，而被细菌、病毒、ATP、β淀粉样蛋白、活性氧等多种内外因素干扰后，NLRP3被激活。NLRP3激活后Caspase-1前体可被ASC（一类蛋白质）所募集，可进一步活化Caspase-1，促使IL-1β、IL-18等关键性致炎因子的成熟，并且其他免疫细胞被唤醒，进而增加趋化等下游因子活性，最终加剧炎性反应，引起焦亡[5]。在生理情况下，细胞焦亡是机体受到外界病原体刺激或自身内源性损伤后引发的一种免疫防御，它能够高效拮抗和清除内、外病原损伤刺激[6]。但是VD可被长时程的、过度的细胞焦亡诱导发病[7]。

据文献报道，天然香豆素类化合物及合成的衍生物是一类新型的神经保护剂，有抗氧化性，能抑制并除去ROS（活性氧），减轻氧自由基引起的损害等[8]。蛇床子素如前所述是一种呋喃香豆素。Zhang X Q等[9]研究显示，蛇床子素能增加SOD的活性，减少丙二醛（MDA）和NO的产生。Chen Z等[10]的研究证实，蛇床子素可激活Nrf2/HO-1信号通路。本研究发现，蛇床子素能改善VD大鼠的认知行为功能，且能降低海马组织中NLRP3、IL-1β、caspase-1和IL-18蛋白和mRNA的表达。故推测，VD大鼠认知行为的改善可能是由蛇床子素通过抑制NLRP3炎症体激活所致。其具体的作用机制尚需进一步研究，但本研究为蛇床子素在VD治疗中发挥作用提供了新的思路和实验证据。