二甲双胍对宫颈癌干细胞增殖及放化疗敏感性的影响

郭倩 任倩梅 毛熙光 詹平

(西南医科大学附属医院妇科，四川 泸州 646000)

30%～50%的宫颈癌患者在治疗结束后的3～5年内复发和转移，主要原因是放疗和化疗抵抗〔1，2〕。宫颈癌产生放疗和化疗抵抗的根源是宫颈癌干细胞的存在，宫颈癌干细胞是肿瘤转移的主要原因之一，也是肿瘤预后不良的重要因素〔3〕。宫颈癌干细胞是肿瘤组织中具备干细胞特性的极少量细胞，具有自我更新和多向分化潜能，并表达干细胞的表面标志物，其数量在手术及放化疗后反而增多，出现富集现象〔4〕。Chhabra〔5〕的研究发现发生放疗抵抗的宫颈癌细胞具有肿瘤干细胞特性，具有较强的裸鼠移植瘤形成能力和克隆形成能力，同时表达Oct4、CD24和CD44等肿瘤干细胞表面标志物。Liu等〔6〕在探讨宫颈癌放疗抵抗机制时发现，放疗诱导宫颈癌细胞发生上皮间质化是导致宫颈癌干细胞增多的重要原因。因此，提高宫颈癌干细胞放疗敏感性的治疗是改善宫颈癌愈后的关键措施。二甲双胍是被广泛应用于临床治疗糖尿病的首选药物〔7〕。服用二甲双胍的糖尿病患者的肿瘤发病率低于应用其他药物治疗糖尿病的患者〔8〕。二甲双胍不仅对肝癌、肾癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌及宫颈癌细胞具有增殖抑制和凋亡诱导作用〔9，10〕，还对结肠癌干细胞、神经胶质瘤干细胞、胃癌干细胞、胰腺癌干细胞、肝癌干细胞、乳腺癌干细胞及骨肉瘤干细胞的增殖具有抑制作用〔11〕。也有研究证实二甲双胍不仅提高乳腺癌、食管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肝癌、卵巢癌及肺癌的化疗敏感性〔12〕，还能提高食管癌、结直肠癌、肺癌及胰腺癌细胞的放疗敏感性〔13〕。目前，尚未见到二甲双胍对宫颈癌干细胞的增殖及放化疗敏感性的相关报导。因此，本研究应用常规方法从宫颈癌细胞中分选出宫颈癌干细胞，鉴定后进行体外培养，观察二甲双胍对宫颈癌干细胞增殖活性和放化疗敏感性的影响，为提高治疗宫颈癌的疗效和改善患者愈后提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人宫颈鳞癌SiHa细胞株，购买于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.1.2主要试剂与仪器 二甲双胍、顺铂、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素、碘化丙啶(Sigma-Aldrich公司)；RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、重组人表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(Gibco公司)；CD24-FITC单克隆抗体、CD24同型对照、CD44-PE单克隆抗体、CD44同型对照(BD Pharmagen公司)；兔抗人CD133、Oct4、Nanog、性别决定基因相关转录因子(Sox)-2、β-actin单克隆抗体(Abcam公司)；Alexa Fluor®594标记的山羊抗兔IgG(Thermo公司)；Accutase®细胞消化液(嘉美生物技术公司)；超净工作台、CO2培养箱、全自动酶标仪(Thermo公司)；荧光显微镜、倒置相差显微镜(Olympus公司)；电泳仪、电转槽、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；低温细胞离心机(StatSpin公司)。

1.2实验方法

1.2.1人宫颈鳞癌SiHa细胞的培养 将装有SiHa细胞的冻存管从液氮罐中取出，在37℃水浴箱中快速融化成液态，将复苏的SiHa细胞以1×104个/ml的浓度接种到培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基5 ml，置入37℃、5%CO2培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞贴壁情况，待大部分细胞贴壁后首次换液，培养至贴壁细胞达到80%融合后，进行传代。

1.2.2宫颈癌干细胞的分选 根据Chopra等〔14〕的方法，应用流式细胞仪分选CD44+/CD24+SiHa细胞进行悬浮培养富集宫颈癌干细胞。方法如下：收集第3代处于对数生长期的Siha细胞，PBS洗涤后加入0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，倒置相差显微镜下观察细胞变圆后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，重悬细胞，以5×106个/ml的浓度接种到流式细胞检测管中，随后加入0.625 μl CD24-FITC单克隆抗体和CD44-PE单克隆抗体，同时设同型对照管，4℃避光孵育30 min，期间用一次性移液管吹打混匀3次，1 000 r/min离心5 min，用流式细胞术缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪上分选CD44+/CD24+SiHa细胞，使细胞纯度>95%。将分选出的CD44+/CD24+SiHa细胞以1×106个/ml的浓度接种到培养皿中，用肿瘤干细胞培养基(1 ml DMEM/F12加入10 ng成纤维细胞生长因子、20 ng重组人表皮生长因子、25 mg胰岛素和4 ml胎牛血清)在37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养，每日换液，7 d后细胞球形成，继续培养7 d，细胞球结构变紧密后，按1∶3传代，取第3代细胞球进行宫颈癌干细胞鉴定及实验。

1.2.3宫颈癌干细胞的鉴定 参照Liu等〔15〕的方法，应用免疫荧光染色法检测干细胞标记物CD133和Oct4的表达。取第3代的肿瘤细胞球，用Accutase细胞消化液孵育3 min，制成单细胞悬液，以1×107个/ml的浓度接种于事先置于一次性6孔培养板各孔中的盖玻片上，用10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养24 h，取出贴有细胞的盖玻片，4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100透膜3 min，10%山羊血清封闭45 min，滴加兔抗人CD133、Oct4单克隆抗体，4℃避光孵育，12 h后滴加荧光标记山羊抗兔IgG，避光孵育30 min，荧光显微镜下观察。

1.2.4二甲双胍最佳作用浓度与时间的筛选 取第3代宫颈癌干细胞悬液，以6×104个/L浓度接种于一次性96孔培养板的各孔内，以DMSO为空白组，每孔内细胞悬液体积为100 μl，37℃、5%CO2培养24 h，去除未贴壁细胞后，分别加入终浓度为5、10、20 mmol/L的二甲双胍溶液，继续培养24、48、72 h，不同浓度和作用时间分别设6个复孔，在不同时间点取出培养板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，避光孵育4 h，随后每孔加入DMSO溶液150 μl，室温混匀10 min，在酶标仪上波长570 nm处检测每孔的吸光度值(OD值)，根据公式：细胞存活率=(实验组OD值-对照组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%计算各组宫颈癌干细胞的存活率。

1.2.5顺铂最佳作用浓度的筛选 取第3代宫颈癌干细胞悬液，以6×104个/L浓度接种于一次性96孔培养板的各孔内，以DMSO为空白组，每孔内细胞悬液体积为100 μl，37℃、5%CO2培养同1.2.4。

周恩来和郭沫若此时正在武汉组织纪念抗战一周年群众歌咏大会，得知桂涛声和冼星海创作了这首《在太行山上》，便前往冼星海住所先睹为快。

1.2.6放疗最佳作用剂量的筛选 取第3代宫颈癌干细胞悬液，以6×104个/L浓度接种于一次性96孔培养板的各孔内，以DMSO为空白组，每孔内细胞悬液体积为100 μl，37℃、5%CO2培养24 h，去除未贴壁细胞后，分别用2、4、8、16 Gy的60-钴γ射线照射24、48、72 h，不同剂量和作用时间分别设6个复孔，在不同时间点取出培养板，后续培养同1.2.4。

1.2.7实验分组与细胞干预 取第3代宫颈癌干细胞制成细胞悬液，分别接种于不同培养瓶中，随机分为6组：①对照组：不做任何处理的宫颈癌干细胞；②二甲双胍组：用20 mmol/L二甲双胍处理细胞72 h；③放疗组：用8 Gy的60-钴γ射线照射72 h；④二甲双胍+放疗组：用20 mmol/L二甲双胍处理细胞的同时用8 Gy的60-钴γ射线照射，共72 h；⑤化疗组：用20 nmol/L顺铂处理细胞72 h；⑥二甲双胍+化疗组：同时用20 mmol/L 二甲双胍和20 nmol/L顺铂处理细胞72 h。每组3瓶。

1.2.8MTT法检测宫颈癌干细胞的存活率 取各组细胞制成细胞悬液，以6×104个/L浓度接种于一次性96孔板的各孔内，以DMSO为空白组，每组6个复孔，每孔内细胞悬液体积为100 μl，37℃、5%CO2培养24 h，去除未贴壁细胞，后续培养同1.2.4。

1.2.9流式细胞术检测二甲双胍对胃癌干细胞凋亡的影响 取各组细胞制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，收集细胞至流式专用离心管中，每管内加入70%乙醇1 ml，4℃固定24 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS悬浮细胞悬浮，向每管内加入0.5 ml碘化丙啶，37℃避光染色30 min，在流式细胞仪上波长488 nm处检测细胞凋亡率。

1.2.10Western印迹检测各组宫颈癌干细胞Nanog和Sox-2的表达 收集各组细胞，用全细胞裂解液裂解细胞，10 000 r/min离心3 min，取上清液，考马斯亮蓝法检测试提取蛋白样品浓度，煮沸法使样品变性，10%凝胶电泳、转膜、3%牛血清白蛋白室温封闭30 min，加入兔抗人Nanog、Sox-2单克隆抗体，4℃孵育12 h，随后用山羊抗兔IgG室温孵育1 h，应用化学发光法在凝胶成像系统中显色，以β-actin为内参考，用Quantiy One软件测量条带灰度，以目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值来半定量目的蛋白。

1.3统计学分析 应用GraphPad Prism 6.0软件进行实验数据的统计学分析与绘图，计量数据采用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。

2 结 果

2.1宫颈癌干细胞的鉴定 倒置相差显微镜下观察，培养1 d，SiHa细胞呈球形悬浮于培养基中；培养7 d后，细胞聚集生长，形成球状细胞团，结构较松散；培养14 d后，肿瘤细胞球体积增大，细胞排列紧密，界限不清，即出现肿瘤干细胞富集。免疫荧光染色结果显示，肿瘤球中的细胞表达CD133(绿色荧光)和Oct4(红色荧光)。见图1。

图1 宫颈癌干细胞的鉴定(免疫荧光染色，×400)

2.2二甲双胍最佳作用浓度与时间的筛选 MTT检测结果显示，随着二甲双胍作用浓度的升高和作用时间的延长，宫颈癌干细胞的存活率呈下降趋势；作用24 h，20 mmol/L浓度组细胞存活率低于0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L浓度组，但差异无统计学意义(P>0.05)；作用48和72 h，10 mmol/L和20 mmol/L浓度组细胞存活率显著低于0 mmol/L和5 mmol/L浓度组(P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L浓度组作用48 h和72 h，细胞存活率显著低于作用24 h (P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L浓度组作用72 h，细胞存活率显著低于作用48 h(P<0.05)。见表1。

表1 二甲双胍对宫颈癌干细胞存活率的影响

2.3顺铂最佳作用浓度的筛选 MTT检测结果显示，作用48 h和72 h后，20 nmol/L和40 nmol/L浓度组细胞存活率显著低于0 nmol/L和10 nmol/L浓度组(P<0.05)；10 nmol/L浓度组作用72 h，细胞存活率显著低于作用24 h (P<0.05)；20 nmol/L和40 nmol/L浓度组作用48 h和72 h，细胞存活率显著低于作用24 h (P<0.05)。见表2。

表2 顺铂对宫颈癌干细胞存活率的影响

2.4放疗最佳作用剂量的筛选 MTT检测结果显示，作用48 h和72 h后，8、16 Gy剂量组细胞存活率显著低于0、4 Gy剂量组(P<0.05)；8、16 Gy剂量组作用48 h和72 h，细胞存活率显著低于作用24 h(P<0.05)。见表3。

表3 放疗对宫颈癌干细胞存活率的影响

2.5二甲双胍对各组宫颈癌干细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，二甲双胍组、放疗组、二甲双胍+放疗组、化疗组、二甲双胍+化疗组细胞均显著低于对照组(P<0.05)；二甲双胍+放疗组、二甲双胍+化疗组细胞存活率显著低于二甲双胍组和放疗组(P<0.05)；二甲双胍+化疗组细胞存活率显著低于化疗组(P<0.05)。见表4。

表4 二甲双胍对各组宫颈癌干细胞增殖和凋亡的影响

2.6二甲双胍对各组宫颈癌干细胞凋亡的影响 流式检测结果显示，二甲双胍组、放疗组、二甲双胍+放疗组、化疗组、二甲双胍+化疗组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)；二甲双胍+放疗组、二甲双胍+化疗组细胞凋亡率显著高于二甲双胍组和放疗组(P<0.05)；二甲双胍+化疗组细胞凋亡率显著高于化疗组(P<0.05)。见表4。

2.7二甲双胍对宫颈癌干细胞中Nanog表达的影响 Western印迹检测结果显示，各组细胞中Nanog蛋白的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图2。

1～6：对照组、二甲双胍组、放疗组、二甲双胍+放疗组、化疗组、二甲双胍+化疗组图2 Western印迹检测Nanog表达

3 讨 论

针对宫颈癌干细胞的治疗有望解决宫颈癌的放化疗抵抗问题。近年来，虽然对宫颈癌干细胞的生物学特性和表面标志物等方面有了较深入的研究，但宫颈癌肿瘤干细胞的放化疗抵抗和自我更新机制尚未完全明确，应用化合物有效控制宫颈癌干细胞生长的研究不多〔16〕。Nayak等〔17〕应用小分子化合物体外处理宫颈癌干细胞可提高该细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。Yokoi等〔18〕的研究发现一种选择性的转录活性抑制剂可有效清除宫颈癌干细胞。Bigoni-Ordóez等〔19〕的研究则发现碘可以降低宫颈癌干细胞表面标志物的表达，从而减弱肿瘤干细胞的自我增殖能力。张燕华等〔20〕的研究发现，姜黄素抑制宫颈癌干细胞的增殖与聚集并提高其化疗敏感性。王雪莉等〔21〕研究证实，紫花牡荆素可抑制宫颈癌干细胞的增殖。以上对所应用药物的研究均处于基础体外实验阶段，与临床相距甚远。于是，本研究把着眼点放在了临床常用药上，也为老药新用开辟新思路。二甲双胍是具有良好耐受性的抗肿瘤药物〔22〕。临床试验已展开二甲双胍对卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌等的治疗〔23〕。本研究通过二甲双胍体外干预宫颈癌干细胞也观察到二甲双胍具有抑制宫颈癌干细胞增殖及和提高放化疗敏感性的作用。

王华等〔24〕的研究证实，宫颈癌干细胞是人宫颈癌SiHa细胞株对顺铂产生耐药的主要机制之一。Gu等〔25〕、Zhang等〔26〕、Yang等〔27〕和Wu等〔28〕的研究均证实，CD24+/CD44+可作为宫颈癌干细胞的表面标志物。Oct4是一种常见的干细胞相关基因，作为重要的转录因子在干细胞抗凋亡的过程中发挥重要的作用〔29〕。本研究免疫荧光染色结果提示所分选的宫颈癌干细胞可用于本实验。本研究MTT结果提示二甲双胍对宫颈癌干细胞增殖的抑制作用呈时间与剂量依赖性。为了确定放疗剂量与顺铂作用浓度，本研究分别应用梯度放疗剂量和顺铂浓度作用于宫颈癌干细胞，MTT结果显示宫颈癌干细胞的存活率对放疗和化疗没有明显的时间和剂量依赖性。以上结果与等Kwon等〔30〕和Tyagi等〔31〕的研究结果一致，两项研究均证实宫颈癌干细胞具有放疗和化疗抵抗的特性。

临床上普遍认为宫颈癌放疗与化疗失败的主要原因是局部肿瘤增殖不受控制或远处转移，且宫颈癌根治术后经放化疗复发的患者再次接受放疗时疗效较差，以上情况均与放化疗抵抗有关，而肿瘤干细胞可能是其根源〔32，33〕。本研究细胞存活和凋亡结果说明二甲双胍可能具有放疗和化疗协同效应，可提高宫颈癌干细胞对辐射和顺铂的敏感性。肿瘤细胞来源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞的干性是肿瘤生长、侵袭、转移及复发的主要原因。王华等〔34〕的研究显示，Oct3/4可通过上调肿瘤干细胞自我更新的关键性基因Nanog来维持肿瘤干细胞的干性。Nanog是特异性表达于胚胎干细胞中的基因，在维持干细胞的自我更新和亚全能性方面发挥关键性作用，也是细胞全能性或多能性的标志物〔35，36〕。本研究Western印迹检测结果说明二甲双胍可能不能改变宫颈癌干细胞的干性。

综上所述，二甲双胍具有抑制宫颈癌干细胞增殖的作用，并可提高宫颈癌干细胞对放疗或化疗的敏感性，但不影响宫颈癌干细胞的干性。宫颈癌干细胞可能成为二甲双胍的又一治疗靶细胞，为二甲双胍在放化疗增敏的临床应用提供了实验依据。