LncRNA LINC01446靶向miR-432-5p对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其分子机制

田贵金 刘军红 陈晶 张小龙 杨志森

(1邯郸市第一医院综合外科，河北 邯郸 056002；2武安市第一人民医院产科)

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率高，手术和放化疗是其主要治疗手段，肝癌的复发和转移严重影响患者治疗效果、患者预后和生存期，深入研究肝癌的分子机制，寻找分子靶标，对于肝癌的靶向治疗具有重要的意义〔1,2〕。研究表明长链非编码RNA(LncRNA)参与多种肿瘤的发生、发展及预后，部分LncRNA也参与肝癌的发生发展过程，可作为诊断的生物标志物或治疗的靶点〔3〕。LINC01446是一种新的LncRNA，研究发现敲低LINC01446可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖，阻止细胞周期进展并减少体外侵袭〔4〕。还有研究报道LINC01446与胃癌的总体存活率相关〔5〕。此外研究发现miRNA也参与肿瘤的发展发展，麦冬腺苷-B通过Linc00668/miR-432-5p抑制人肺腺癌细胞的转移和上皮-间质转化〔6〕。LncRNA癌症易感性候基因(CASC)15通过竞争性结合miR-432-5p上调Toll-样受体(TLR)4而促进心脏肥大〔7〕。然而，LINC01446和miR-432-5p对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及LINC01446与miR-432-5p之间的关系尚未清楚。本实验旨在研究LINC01446和miR-432-5p对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及LINC01446是否通过调控miR-432-5p影响肝癌细胞的进展，为肝癌的分子靶向治疗提供参考和新靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1肝癌组织和肝癌细胞来源 肝癌组织和癌旁组织均取自邯郸市第一医院，患者均知情。正常肝细胞THLE-2和肝癌细胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3购自美国菌种保藏中心(ATCC)。

1.1.2主要试剂 RPMI1640培养基购自美国Sigma公司；荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen公司；RIPA蛋白裂解液、四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室、基质胶购于美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司。si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p、anti-miR-con、anti-miR-432-5p载体质粒购自北京源生思创生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 正常肝细胞THLE-2和肝癌细胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3用RPMI1640培养基培养，取对数生长期细胞Hep3B，将si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p分别转染至Hep3B细胞中，分别记为si-con组、si-LINC01446组、pcDNA组、pcDNA-LINC01446组、miR-con组、miR-432-5p组；将si-LINC01446质粒分别与anti-miR-con、anti-miR-432-5p共转染至Hep3B细胞中，分别记为si-LINC01446+anti-miR-con组、si-LINC01446+anti-miR-432-5p组；以正常培养的细胞作为对照(NC)组。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC01446和miR-432-5p表达水平 提取癌组织及各组细胞的总RNA，反转录成cDNA，进行PCR扩增，相对表达量用2-△△Ct法计算。LINC01446上游引物序列：5′-ACTGCAGCATTCGAGAGGTT-3′，下游引物序列：5′-TCCACACATGGCATACACCT-3′；β-actin上游引物序列：5′-CCTGTGGCATC-CACGAAACT-3′，下游引物序列：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′；miR-432-5p上游引物序列：5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游引物序列：5′-CTTGGAGTAGGTCATTGGGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3Western印迹检测细胞核增殖抗原标记物(Ki67)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β-连环蛋白(catenin)、c-myc蛋白和糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白表达水平 提取各组细胞总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后室温封闭2 h，再分别加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育90 min，分析蛋白条带吸光度，计算蛋白相对表达水平。

1.2.4MTT试剂盒检测细胞存活率 各组细胞培养48 h时，按试剂盒说明操作，检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，用结合缓冲液重悬，按照试剂盒说明书，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 侵袭实验：用基质胶包被Transwell小室上室，然后取200 μl细胞悬液种于其中，培养24 h，多聚甲醛固定后用0.1%结晶紫染色，显微镜观察并随机选取5个视野拍照并计数。迁移实验：不用基质胶包被Transwell上室，其余同侵袭实验步骤。

1.2.7双荧光素酶报告实验 将LINC01446野生型和突变型荧光素酶表达载体分别与miR-con和miR-432-5p 共转染至Hep3B细胞，按照说明书进行检测。

1.2.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达 与癌旁组织相比，肝癌组织中LINC01446表达水平显著升高，miR-432-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表1；与正常肝细胞THLE-2相比，肝癌细胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3中LINC01446表达水平显著升高，miR-432-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表2。可见，肝癌组织和肝癌细胞系中LINC01446高表达，miR-432-5p低表达。

表1 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌组织和癌旁组织中的表达

表2 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌细胞系和正常肝细胞中的表达

2.2沉默LINC01446抑制肝癌细胞Hep3B存活和诱导细胞凋亡 与si-con组相比，si-LINC01446组LINC01446表达水平显著降低，Ki67表达水平和细胞存活率显著降低，Cleaved caspase-3表达水平和细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图1、表3、图2。

图1 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率

表3 沉默LINC01446抑制肝癌细胞Hep3B存活、迁移、侵袭、凋亡和转移相关蛋白表达

图2 Western印迹检测Ki67和Cleaved caspase-3蛋白表达

2.3沉默LINC01446抑制肝癌细胞Hep3B迁移和侵袭 与si-con组相比，si-LINC01446组MMP-2、MMP-9表达水平及Hep3B细胞给迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。见表3、图3、图4。

图3 Transwell检测肝癌细胞迁移(结晶紫染色，×200)

图4 Western印迹检测MMP-2和MMP-9表达

2.4LINC01446靶向调控miR-432-5p表达 StarBase预测显示LINC01446与miR-432-5p存在结合位点(图5)。miR-432-5p与WT-LINC01446共转染的Hep3B细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)(表4)。si-LINC01446组miR-432-5p表达水平显著高于si-con组(4.19±0.35 vs 1.00±0.11,P<0.05)；pcDNA-LINC01446组miR-432-5p表达水平显著低于pcDNA组(0.39±0.06 vs 0.96±0.09；P<0.05)。

表4 双荧光素酶报告实验

图5 LINC01446与miR-432-5p互补的核苷酸序列

2.5miR-432-5p抑制肝癌细胞增殖、转移、侵袭和诱导细胞凋亡 与miR-con组相比，miR-432-5p组MMP-2、MMP-9表达水平和迁移、侵袭数量显著降低，Ki67表达水平和细胞存活率显著降低，Cleaved caspase-3表达水平和细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图6、表5。

图6 Western印迹检测Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表达

表5 miR-432-5p抑制肝癌细胞增殖、转移、侵袭和诱导细胞凋亡

2.6干扰miR-432-5p部分逆转沉默LINC01446抑制肝癌细胞增殖、转移、侵袭和诱导细胞凋亡的作用 与si-LINC01446+anti-miR-con组相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p组miR-432-5p表达水平显著降低，Ki67表达水平和细胞存活率显著升高，MMP-2、MMP-9表达水平和迁移、侵袭细胞数显著升高，Cleaved caspase-3表达水平和细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图7，表6。

表6 干扰miR-432-5p部分逆转沉默LINC01446抑制肝癌细胞增殖、转移、侵袭和诱导细胞凋亡的作用

2.7LINC01446调控miR-432-5p表达影响肝癌细胞Wnt信号通路 与si-con组相比，si-LINC01446组β-catenin、c-myc表达水平显著降低，GSK-3β表达水平显著升高(P<0.05)；与si-LINC01446+anti-miR-con组相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p组β-catenin、c-myc表达水平显著升高，GSK-3β表达水平显著降低(P<0.05)。见图8，表7。可见，沉默LINC01446抑制Wnt信号通路的激活，而干扰miR-432-5p部分逆转沉默LINC01446对Wnt信号通路的抑制作用。

1～4：si-con组，si-LINCO1446组，si-LINC01446+anti-miR-con组，si-LINCO1446+anti-miR-432-5p组；图8同图7 Western印迹检测Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表达

图8 Western印迹检测β-catenin、c-myc和GSK-3β蛋白表达

表7 干扰miR-432-5p和沉默LINC01446对肝癌细胞Wnt信号通路的影响

3 讨 论

肝癌是预后较差的恶性肿瘤，靶向治疗是中晚期治疗的新方法，寻找更多肝癌相关的特异性靶点对临床肝癌的靶向治疗具有重要意义〔8〕。研究发现LncRNA参与肝癌的发生发展过程，与肝癌的发生、转移、凋亡有关〔9〕。如沉默LncRNA核富含丰富的转录本(NEAT)1表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭〔10〕。有研究报道LncRNA LINC01446中的单核苷酸多态性(SNP)与放线菌的相对丰度相关，而放线菌与炎症性肠病相关〔11〕。LncRNA LINC01446通过调节miR-489-3p促进胶质母细胞瘤的进展〔4〕。本实验结果显示，在肝癌组织和肝癌细胞中LINC01446高表达，沉默LINC01446后，细胞存活率和迁移、侵袭细胞数显著降低，而细胞凋亡率显著升高，且Ki67、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低，Cleaved caspase-3表达水平显著升高。Ki67是DNA合成相关酶，其表达水平的高低可以用以判断细胞增殖活性，研究发现Ki67在肝癌患者中高表达，影响患者预后〔12〕。MMP-2、MMP-9均属于MMP家族，与细胞迁移和侵袭相关，上调MMP-2/MMP-9，促进肝癌细胞侵袭和转移〔13〕。Cleaved caspase-3是细胞凋亡相关蛋白，激活caspase-3活化为Cleaved caspase-3可促进细胞凋亡〔14〕。本实验结果说明沉默LINC01446可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡。

研究发现miRNA与肿瘤细胞增殖、转移及复发密切相关，通过调控miRNA的表达可抑制肿瘤的进展〔15〕。有研究报道过表达circ_001569通过调控miR-411-5p和miR-432-5p促进肝癌细胞的生长，迁移和侵袭〔16〕。hsa_circ_0008039通过调节miR-432-5p促进乳腺癌细胞增殖和迁移〔17〕。本实验结果说明过表达miR-432-5p可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡。且本实验还发现，LINC01446靶向调控miR-432-5p，干扰miR-432-5p部分逆转了沉默LINC01446对Hep3B细胞的作用。提示，LINC01446可能通过调控miR-432-5p影响肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路是Wnt的经典信号通路，研究发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与肝癌的发生发展密切相关，研究肝癌中Wnt/β-catenin信号通路的作用机制可为其作为靶点用于肝癌的临床治疗提供理论依据〔18〕。β-catenin的异常表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路，c-myc是一种癌基因，也是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，有研究表明SNHG16通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖和迁移〔19〕。GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路的关键调节因子，GSK-3β能磷酸化β-catenin使其降解，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活〔20〕。人参皂苷Rh2通过激活GSK-3β，降解β-catenin抑制肝癌的转移〔21〕。本实验结果说明沉默LINC01446抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。而干扰miR-432-5p部分逆转沉默LINC01446对Wnt信号通路的抑制作用。提示，LINC01446可能通过调控miR-432-5p影响Wnt/β-catenin信号通路的激活。

综上所述，沉默LINC01446可通过调控miR-432-5p和Wnt信号通路抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。