人参皂苷Rg3对大鼠颈动脉球囊损伤后TGF-β1/Smads通路的影响

陈文明 蹇明辉 赵然尊 石蓓

(遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563099)

在冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的治疗过程中，经皮冠状动脉介入(PCI) 能快速开通血管，恢复血流，从而改善心肌的供血、供氧。目前，PCI已成为治疗CHD的重要方法之一，对患者的治疗效果明显；但从患者远期疗效来看，血管内再狭窄(VRS)的发生，反而影响了患者的远期治疗效果。因此，怎么解决PCI术后VRS的问题已成为防治CHD的研究热点。人参皂苷(GS)Rg3是从人参中提取的一种四环三萜皂苷类化合物，具有多种药理学活性。近年来有大量文献报道，GSRg3能抑制肿瘤细胞侵袭和转移，诱导肿瘤细胞凋亡，提高机体免疫力，而且对心脑血管也具有保护作用〔1～4〕。本课题组前期研究发现，在大鼠颈动脉损伤后，GSRg3通过促进血管平滑肌细胞的凋亡，抑制炎症相关因子的表达，进而抑制血管内膜的增生〔5,6〕，其具体的作用机制尚不清楚。本实验在前期研究的基础上，进一步探讨GSRg3对球囊损伤颈动脉后血管内膜增生的作用机制是否与转化生长因子(TGF)-β1/Smads信号通路有关，为 PCI治疗CHD提供理论实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择40只健康雄性SD大鼠(SPF级)，体重 280～320 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2主要药品与试剂 GSRg3：批号为ZL20161016，纯度>98%，购自上海笃玛生物科技有限公司；TGF-β1和β-actin抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；SP 法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA 提取试剂盒均购自成都精迈生物科技有限公司；PCR扩增试剂盒购自宝生物工程大连有限公司。

1.3主要仪器 PTCA球囊扩张导管(2.0 mm×12.0 mm)购自微创医疗器械(上海)有限公司；BX43正置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；Real-time PCR仪和酶标仪均购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4制备大鼠颈动脉球囊损伤模型 根据课题组前期实验基础〔5，6〕，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，然后再经腹腔注射肝素钠625 U/kg，于手术台上固定大鼠，于颈部正中脱毛、剪开切口，分离左侧颈总动脉，然后找到颈外、颈内动脉分叉处，将分离出的颈外动脉离分叉处约1 cm 将其结扎；用动脉夹临时阻断颈左颈总动脉血流，由颈外动脉将球囊扩张导管(2.0 mm×12.0 mm)插入至颈总动脉，充盈球囊扩张导管，将其缓慢来回抽拉3次，退出球囊，然后结扎颈外动脉。预防感染：术后立即给予颈动脉球囊损伤大鼠肌肉注射青霉素(30万单位)，每日1次，连续3 d，进行普通饲料，自由饮水。

1.5实验分组 大鼠随机为成 4 组：假手术组，模型组，GSRg3低剂量组(5 mg/kg)，GSRg3高剂量组(10 mg/kg)，每组10只；假手术组只分离颈左总动脉血管，其余各组大鼠均用球囊扩张导管(2.0 mm×12.0 mm)损伤左颈总动脉，术后待大鼠清醒后按照上述实验分组，灌胃给药，每日1次，连续14 d，假手术组和模型组给予等量生理盐水〔5，6〕。

1.6苏木素-伊红(HE)染色 给予颈动脉损伤模型大鼠连续灌胃给药14 d后，将模型大鼠麻醉处死，取出颈动脉损伤部位血管，经石蜡包埋处理，进行HE染色。使用Image-Pro Plus(IPP)图像分析软件测量模型大鼠颈动脉损伤血管的管腔面积、内膜面积和中膜面积，计算内膜/中膜的面积比值〔5，6〕。

1.7免疫组织化学法检测TGF-β1蛋白表达水平 将上述包埋处理的蜡块，进行石蜡切片；将切片脱蜡、水合，滴加3%H2O2室温避光孵育后，用微波炉进行抗原修复，根据免疫组织化学ABC法，滴加适当比例稀释的一抗抗体(TGF-β1 1∶200，β-actin 1∶200)4℃孵育过夜，再滴加二抗37℃孵育1 h；在普通光学显微镜下，用二氨基联苯胺(DAB)法显色，用苏木素返蓝，然后脱水封片。颈动脉血管组织中出现棕黄色颗粒，即为 TGF-β1蛋白阳性表达信号，利用IPP图像分析软件对切片中免疫组化染色的阳性表达进行定量分析，并计算出阳性染色结果的平均光密度值。

1.8Real-time PCR检测TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达 用Trizol一步提取法，提取颈动脉损伤血管组织总RNA，检测RNA的浓度及其纯度，进行逆转录反应，然后再进行PCR扩增。引物序列：TGF-β1：上游引物：5′-GGTGGACCGCAACAACG-3′，下游引物：5′-TGAGCACTGAAGCGAA AGC-3′，327 bp；Smad2：上游引物：5′-AAGCCATCACCACTCAGAATTG-3′，下游引物：5′-CACTGATCTACCGTATTTGCTGT-3′，100 bp；Smad3：上游引物：5′-TGGCTACCTGAGTGAAGATGG-3′，下游引物：5′-AGTTATTGTGTGCTGGGGACA-3′，110 bp；Smad7：上游引物：5′-CCAACTGCAGACTGTCCAGA-3′，下游引物：5′-CAGGCTCCAGAAGAAGTTGG-3′，106 bp；β-actin：上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCAATGGTGAT-3′，392 bp。将扩增结果CT值采用2-△△Ct法进行分析，观察目的基因表达的表达情况。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1GSRg3 对球囊损伤后大鼠颈动脉血管内膜增生的影响 假手术组血管内膜光滑，无明显增厚现象，模型组颈动脉血管内膜增厚较假手术组明显增加(P<0.01)，血管管腔缩小，同时，内膜/中膜面积比也明显增加(P<0.01)；与模型组相比，给予GSRg3干预治疗后，颈动脉血管内膜增厚的程度明显减轻(P<0.01)，血管管腔增大，内膜/中膜面积比显著下降(P<0.01)。见图1，表1。说明GSRg3 具有抑制颈动脉血管经球囊损伤后血管内膜的增生作用。

图1 GSRg3 对球囊损伤后大鼠颈动脉血管内膜增生的影响(HE，×100)

2.2GSRg3对球囊损伤后大鼠颈动脉血管TGF-β1蛋白表达的影响 用免疫组织化法检测结果显示，假手术组颈动脉血管见有少量TGF-β1阳性表达，模型组颈动脉血管TGF-β1蛋白表达较假手术组比较明显增强(P<0.01)；与模型组比较，给予GSRg3干预后，颈动脉血管TGF-β1的蛋白表达明显降低(P<0.01)。见表1、图2。说明GSRg3能抑制颈动脉血管经球囊损伤后TGF-β1蛋白表达。

图2 GSRg3对球囊损伤后大鼠颈动脉血管TGF-β1蛋白表达的影响(免疫组织化学法，×400)

2.3GSRg3对球囊损伤后大鼠颈动脉血管TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达水平的影响 与假手术组比较，模型组损伤血管TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平显著增加(P<0.01)，Smad7 mRNA表达水平明显下降(P<0.01)；与模型组比较，给予GSRg3干预后，损伤血管TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平明显下降(P<0.01)，Smad7 mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。见表1。说明GSRg3能调节球囊损伤后大鼠颈动脉血管TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 的mRNA表达。

表1 各组颈动脉血管内膜、中膜及内膜/中膜面积、TGF-β1蛋白及TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达比较

3 讨 论

TGF-β1在细胞的生长、分化及在多种生理、病理过程中起重要调节作用，是TGF-β亚型中的一种。TGF-β1主要在血管内皮细胞(VEC)、血管平滑肌细胞(VSMC)、血管成纤维细胞(VFb)等细胞中呈高表达，与血管损伤后VRS及血管纤维化重塑密切相关〔7〕。研究发现，TGF-β1主要是经过细胞内信号转导通路发挥作用，迄今为止，TGF-β1的唯一作用底物是Smads〔8〕。Smads是线虫Sma蛋白，与果蝇Mad蛋白具有同源性的蛋白家族，它们可以直接将TGF-β1信号经细胞膜受体导入细胞内。膜受体激活的Smad(R-Smads)，包括Smad2、3等，它们可与TGF-β1受体直接作用，经磷酸化后，与Smad4结合，转位入核，从而调节其下游相关靶基因转录；在TGF-β1-Smad信号转导通路中，Smad7具有抑制作用，可与R-Smads竞争性地结合受体，阻止R-Smads的磷酸化，从而阻断TGF-β1的效应〔8〕。

近年来研究报道，在动脉粥样硬化斑块中和发生VRS的部位均有TGF-β1和Smads基因的表达，且具有较强的活性〔9，10〕。TGF-β1通过Smad蛋白信号转导作用，促进VSMC的增殖、迁移及血管纤连蛋白的合成，从而引起细胞外基质的沉积，导致血管内膜增殖〔11，12〕。大鼠颈动脉损伤后TGF-β/Smads信号通路被激活，促进血管平滑肌细胞的增殖迁移，引起血管内膜的增生〔13〕。本实验研究结果印证了TGFβ1/Smads信号通路对血管内膜增生具有促进作用，提示大鼠颈动脉球囊损伤后，GSRg3能减轻血管内膜的增生作用，可能与抑制TGFβ1的表达和Smads途径的激活有关，从而减少细胞增殖信号的转导。

综上所述，GSRg3能抑制球囊损伤后血管内膜增生，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路的表达有关。