“疏肝降脂”针法治疗非酒精性脂肪肝动物模型及疗效

王喜臣 赵杰 贾炳超 刘新宇 胡英华

(长春中医药大学 1医药信息学院，吉林 长春 130117；2针灸推拿学院；3药学院)

脂肪肝属于良性病变，但最终可导致肝细胞纤维化，甚至肝硬化与癌变〔1〕。非酒精性脂肪肝(NAFLD)在人们追求饮食享受的过程中逐渐发展为一种社会疾病。由于目前尚缺乏有效的治疗方法，且发病年龄日趋下降与发病率逐渐上升，已引起了相关研究人员的高度关注。研究表明，肝组织PGC-1α、PPARα等的基因表达水平与NAFLD的形成和发展关系密切〔2〕，而且PGC-1α、PPARα信号通路直接或间接参与白色和褐色脂肪代谢活动，促进能量与脂肪的代谢，进而减少脂质沉积。中医治疗NAFLD疗效显著〔3,4〕，针灸可起到疏肝降脂作用，故“疏肝降脂”针法的相关穴位与PPARα、PGC-1α信号通路具有可能潜在的相关性。本研究探讨疏肝降脂针法治疗NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择SPF级SD雄性大鼠40只，体质量160～200 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。

1.2主要试剂与仪器 无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司，批号：20181023；甲醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170912；二甲苯，广东光华科技股份有限公司，批号：20200902； 苏木素-伊红(HE)染色试剂盒，碧云天，批号：c0105s； 高线切片石蜡，上海华永石蠟有限公司，批号：20171106；中性树脂，国药集团化学试剂有限公司，批号：20130619； 蛋白Marker，碧云天，P0068BCA；蛋白浓度测定试剂盒，碧云天，批号：P0012S； 抗UCP2抗体，博士德生物，批号：A02256-1，无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司，批号：20181023； ddH2O，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号：B14100140； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time Takara，批号：AKF1919A。 脱水机，Leica，产品型号：TP1020 ；包埋机，Leica，产品型号：EG1150H；切片机，Leica，产品型号：RM2235；显微镜，Olympus，产品型号：IX73。

1.3动物分组 将大鼠随机分为空白组(n=8)与实验组(n=32)。将实验组大鼠采用88%鼠粮+10%猪油+2%胆固醇喂养，诱发NAFLD，造模成功后，随机分为模型组(n=8)、针灸治疗组(n=12)、阳性药物对照组(n=12)。

1.4方法 空白组与模型组正常喂养，阳性药物对照组给予多烯磷脂酰胆碱胶囊灌胃，4 g/100 g,每天3次。针灸治疗组选取肝俞、脾俞、足三里、中脘、丰隆，每日1次，每次20 min,各组均观察30 d。

1.5观察指标

1.5.1血脂检测 取血前禁食禁水 12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠(0.4 ml/100 g)，抽取腹主动脉血约 5 ml，10 min 4 000 r/min离心 取上层血清，采用罗氏Cobas C701全自动生化分析仪和检测罗氏 C701生化试剂检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.5.2HE染色石蜡切片的制作过程 (1)取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0.5 cm)投入预先配好的固定液中(10%甲醛溶液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。(2)脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂(80%酒精12 h，90%酒精12 h，95%酒精1 h，95%酒精1 h，100%酒精1 h，100%酒精1 h)，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。(3)浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。(4)切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5 μm厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。(5)脱蜡：常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。染色前，二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精(95%酒精12 h，85%酒精12 h，75%酒精1 h，50%酒精1 h)，最后入蒸馏水，行HE染色。(6)染色：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色10 min。②酸水中分色，各数秒钟。③流水冲洗入蒸馏水片刻。④入酒精伊红染色液染色2 min。(7)：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。(8)封固：将已透明的切片滴上树脂，盖上盖玻片封固。待树脂略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

1.5.3蛋白操作 取大鼠肝组织加入液氮剪碎并研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合物(100∶1)置于冰上 30 min，10 min 12 000 r/min离心后收集上清液，参照 BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定肝组织中总蛋白浓度，配制 12%分离胶、5%浓缩胶，取 20 μg 蛋白上样，待蛋白样品刚进入浓缩胶时电压设置为80 V，进入浓缩胶和分离胶分界线后，电压升高至 120 V，电泳结束后，目的蛋白凝胶转移到 PVDF 膜上，冰上进行转膜，电流为 250 mA，反应时间 90 min，将目的条带剪下，结束后用碧云天洗涤液清洗，加入碧云天封闭液进行10 min封闭，洗涤液溶液清洗后，分别加入一抗(抗-UCP2抗体、PPARα兔单克隆抗体、PGC1α兔单克隆抗体，稀释倍数均为 1∶1 000)，摇床过夜，洗涤液清洗 后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(稀释倍数1∶1 000)，室温下孵育70 min，洗涤液清洗后，ECL显色置于凝胶成像仪中观察各组蛋白表达情况。实验采用Image J软件对Western印迹条带进行采集分析，并计算目的条带相对值。

1.5.4肝脏总RNA提取 ①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从大鼠腹部解剖开，从中取出完整的肝脏组织，置于离心管后立即放入液氮中；②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1 ml Trizol的1.5 ml离心管中，充分混合后于4℃，12 000 r/min离心15 min；③取上清移至新1.5 ml离心管中，加入200 μl氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12 000 r/min离心15 min；④取上清移至新1.5 ml离心管中，加入500 μl异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20 min，于4℃，12 000 r/min离心15 min；⑤弃上清，加入1 ml 75%乙醇(用DEPC水现配现用)，于4℃，12 000 r/min离心5 min，重复此步骤一次；⑥弃上清后，室温干燥5～7 min；⑦加入适量(20～30 μl)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃保存，检测RNA浓度，并电泳检测。

1.5.5RNA浓度测定和电泳检测 取2 μl提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8～2.2。电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90 V电泳30 min，凝胶成像系统观察，并分析结果。

1.5.6肝脏cDNA合成 反应按照TaKaRa公司的PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。(1)(残存的)基因组DNA的除去反应，在PCR管中配制如下缓冲液。混合均匀后，室温放置20～30 min缓冲液具体配制用量，缓冲液试剂与用量：5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μl；gDNA Eraser，1.0 μl。(2)反转录反应，在PCR管中配制如下缓冲液(20 μl)，反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制Master Mix ，然后再分装到每个反应管中。反转录反应试剂与用量：5倍PrimeScript® Buffer 2(for Real Time)，4.0 μl；PrimeScript® RT Enzyme Mix I，1.0 μl；RT Primer Mix，1.0 μl。(3)混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：37℃，15 min；85℃。然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。

1.5.7实时定量PCR 以β-actin作为内参，在实时定量PCR仪(CFX96)中扩增，并测定扩增曲线。反应体系为: 1 μl引物(浓度:10 μmol/L)， 8.5 μl RNase-free water， 12.5 μl TB Green，2μl cDNA(逆转后稀释10倍)，反应结束后读取CT值，并计算2-ΔΔCt，分析各基因表达情况，引物序列分别为：PGC-1α正义链5′- TTCAGGAGCTGGATGGCTTG-3′，反义链5′-GTGAGGACCGCTAGCAAGTT-3′；PPARα正义链5′-AGTCCTGGAACTGAAGCGAC-3′，反义链5′-GTTGAATGGTTGTGGCCAGG-3′；UCP2正义链5′-GCAGTTCTACACCAAGGGCT-3′，反义链5′-GGAAGCGGACCTTTACCACA-3′；β-actin正义链5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反义链5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

1.6统计学方法 运用SPSS23.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1针灸对非酒性脂肪肝大鼠血脂的影响 与空白组相比，模型组和阳性药物对照组TC、TG及LDL-C明显升高(P<0.05)，HDL-C明显降低(P<0.05)。针灸治疗组血脂趋于空白组。 见表1。

表1 各组血脂水平及肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2 mRNA表达比较

2.2针灸改善高脂饮食肝脏组织病理变化 SD大鼠造模成功后HE染色，肝脏细胞肿胀，可见弥散性脂质空泡，经过阳性对照药和针灸之后组织病理变化改善明显脂质空泡变少。见图1。

图1 各组肝组织病理学改变(HE,×400)

2.3针灸调节高脂饮食肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2 mRNA表达 与模型组相比，针灸治疗组肝脏组织中脂质相关代谢基因UCP2表达降低(P<0.05)，而解耦联蛋白PPARα、PGC-1α表达升高(P<0.05)，对引起损伤急性肝细胞凋亡有促进作用，见表1。

2.4针灸调节高脂饮食肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表达 与空白组相比，模型组SD大鼠肝脏组织中脂质相关代谢蛋白PPARα、PGC-1α表达降低(P<0.05)，而解耦联蛋白UCP2表达增加(P<0.05)。经过针灸干预之后，PPARα、PGC-1α表达升高(P<0.05)，解耦联蛋白UCP2表达降低(P<0.05)，趋于空白组。见图2，表2。

1～4：模型组，阳性药物对照组，针灸治疗组，空白组图2 各组肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表达

表2 各组肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表达

3 讨 论

中医中虽无NAFLD病名,但依据NAFLD临床症状与发病原因可归于中医学“积聚”“肥”“肝癖”“痰痞”“胁痛”等范畴〔5,6〕，其病变部位在肝，其形成与肝、胆、肾、脾的生理功能失常密切相关。临床治疗一般应从脾肾亏虚论治，且须肝脾同调，健脾利湿，疏肝降脂。NAFLD病因以湿盛痰瘀为主，多因起居失常、气机不利、情志失调、久病体虚而致正气不足、邪气上逆、湿邪困脾，终致多脏功能失调。临床治疗大多以健脾清热，疏肝降脂为法，化痰祛浊，活血化瘀为则，常需大剂量药物长期治疗，重剂起沉疴。

多烯磷脂酰胆碱胶囊为从植物中提取，可对脂环醇、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、四氯化碳、氨基牛乳糖和乙醇等诱导的急性肝损伤具有肝脏保护作用，修复肝细胞膜，亦有抑制纤维化和脂肪变性功效，临床中常用于辅助治疗急慢性肝炎，药物性肝损伤，肝硬化与肝衰竭等，改善脂质代谢，疗程不少于90 d〔7～9〕。张明丽等〔10〕运用多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)为治疗组治疗NAFLD，与运用肌苷片和维生素C治疗进行治疗的对照组进行统计比较，治疗3个月后，治疗组临床症状、血脂、B超检查结果、肝功能改善情况均优于对照组，表明易善复治疗NAFLD可取得良好的临床疗效。

本研究通过多年临床经验，提出运用“疏肝降脂”针法来治疗非酒精性脂肪肝，临证多选用期门、丰隆、中脘、足三里、三阴交、太冲等穴，结合中医脏腑辨证，标本兼治，内外同调，攻补均施，调气血，补津液，每获良效，为临床中治疗本病提供了新的思路。本研究中所选用穴位中，肝俞益肝通络、疏肝理气，针刺可治疗肥胖、肝气郁滞型慢性胆囊炎、肝气郁结型神志等多种疾病〔11,12〕；脾俞益气健脾，利水湿、助运化，治疗高脂血症疗效确切〔13,14〕；足三里燥脾化湿，生发胃气，临床针灸此穴，无论配伍他穴还是单用本穴，艾灸还是针刺，均有显著的调脂功效，且具有双向调节作用，为临床调脂要穴〔15,16〕，中脘、丰隆通调脾胃气机,使气行津布，且与足三里联合应用，疗效更佳〔17,18〕。

本实验表明“疏肝降脂”针法治疗NAFLD动物模型疗效显著。